杀松材线虫海洋细菌HT-11的鉴定及培养条件研究

[目的]从海洋中分离并筛选具有杀松材线虫活性的细菌。[方法]采用稀释涂布平板法对采自青岛近海海域的样品进行细菌分离,采用浸渍法测定菌株的杀线虫活性,并对筛选菌株的形态学、生理生化特性和16S r DNA序列进行测定,通过单因素试验筛选产生杀线虫活性物质的最适培养条件。[结果]共分离到36株海洋细菌,根据杀线虫活性筛选出1株具有高杀线虫活性的细菌HT-11。该菌株分离自牡蛎,其培养滤液处理松材线虫24 h的校正死亡率高达92.41%。根据形态学、生理生化特性和16S r DNA序列测定及其系统发育分析结果,将菌株HT-11鉴定为考克氏菌属(Kocuria)。单因素试验结果表明,该菌株在营养肉汤(NB)培养基中产生杀线虫活性物质的最适培养条件为:海水浓度100%,初始p H 7.0,培养温度25℃,培养时间3 d。[结论]该研究可为海洋微生物资源的开发及其杀松材线虫天然活性物质的利用提供理论依据。     

发酵法制备蛤蜊ACE抑制肽的菌种筛选

为筛选适用于发酵蛤蜊制备降血压活性多肽的纳豆芽孢杆菌,本试验从7种日本纳豆中初筛6株具有较高蛋白酶活性的纳豆芽孢杆菌株用于发酵蛤蜊,以体外血管紧张素转化酶(ACE)抑制率及多肽含量为评价指标筛选目的菌株。结果表明,共筛选出3株目的菌株(GL-5、GL~(-1)2和GL-25),其发酵产物对ACE抑制率分别为71.55%、78.31%、75.08%,多肽含量分别可达8.12、9.62、8.79mg·m L~(-1)。其中,GL~(-1)2发酵产物经消化酶水解后仍保持68.31%的ACE抑制率,表明其具有较强的抗消化能力。本研究结果为蛤蜊高值化利用开发具有降血压作用的功能食品提供了一定的理论依据。     

酵母甘露聚糖肽对致病性大肠杆菌感染小鼠的保护作用

本试验旨在研究酵母甘露聚糖肽（MTY）对致病性大肠杆菌（PEC）感染小鼠的保护作用。选取无特定病原体（SPF级）昆明小鼠40只,随机分为4组,分别为空白组、模型组、阳性药物组、MTY组（每组10个重复,每个重复1只小鼠）,其中,空白组和模型组灌服生理盐水,阳性药物组灌服抗生素阿莫西林,MTY组灌服酵母甘露聚糖肽。4周后,对模型组、阳性药物组、MTY组昆明小鼠进行致病性大肠杆菌（PEC）攻毒试验,通过对攻毒试验前小鼠肠道微生物分析以及PEC感染后小鼠死亡率、脏器指数、肠道组织以及各器官切片组织病理分析,同时观察体内试验过程小鼠体质变化,综合评价MTY对PEC感染小鼠的保护效果。结果表明,MTY对PEC有抑制作用。与空白组相比,MTY组小鼠肠道微生物菌群有显著性差异（P<0.05）,主要表现为有益菌丰度增加,菌群多样性增加;与模型组相比,MTY处理能有效降低小鼠感染PEC后的死亡率;MTY显著提高了小鼠胸腺指数（P<0.05）,降低脾指数（P>0.05）,并极显著降低肝指数（P<0.01）;MTY抑制了小鼠空肠杯状细胞的减少（P>0.05）;MTY抑制了小鼠肠道中MUC2及ZO-1表达下调（P<0.05）;MTY对感染PEC后的小鼠肠道、肝、脾和肺等器官均起显著的保护作用。由此可见,灌服酵母甘露聚糖肽能减轻PEC对机体的损害,进而对小鼠起保护作用。     

一株具有杀松材线虫活性细菌的筛选和鉴定

为了筛选对松材线虫（Burrmphezen曲“5xylophilus）具有较高杀线活性的细菌,作者从腌制芥菜的表面分离出了一株对松材线虫具有较高杀灭活性的细菌,命名LZ～01。经形态学观察、生理生化分析及对该菌16SrDNA序列分析,将该茵鉴定为BacilluscereusLZ-01。利用该菌培养滤液对松材线虫的杀灭活性进行了检测,结果表明：处理10h时松材线虫的校正死亡率可达100％。     

枯草芽孢杆菌壳聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达及酶学性质

构建了枯草芽孢杆菌CH_2菌株(Bacillus subtilis CH_2)壳聚糖酶基因的真核表达载体p PIC9K-CH2-Cns,在毕赤酵母GS115(Pichia pastoris)中进行重组表达,获得了有生物学活性的重组壳聚糖酶,对重组壳聚糖酶的酶学特性及酶解产物进行了分析。结果显示,重组壳聚糖酶的分子量为29 k D,粗酶的比酶活达到133.60 U/mg,纯化后重组蛋白的比酶活为338.08 U/mg;该酶的最适作用温度为50℃,最适pH为4.5,酶动力学常数Vmax=24.39(μmol/mg)·min~(-1),Km=5.48 mg/m L;Fe2+、K+等对其酶活力有一定的激活作用,其中Mn~(2+)能使酶活力提升2.4倍,Ag~+、Mg~(2+)、Hg~(2+)、EDTA、EGTA和SDS等存在时则对其酶活力有强烈抑制作用。利用重组壳聚糖酶酶解壳聚糖,酶解产物主要为聚合度2~10的壳寡糖,且分布均匀。以上结果表明,枯草芽孢杆菌CH_2菌株壳聚糖酶基因在毕赤酵母GS115中成功表达,获得了一种内切型的高酶活力重组壳聚糖酶,该重组酶具有反应条件温和、酶解产物均一等特点,可被应用于海洋甲壳质加工应用中。     

海藻酸单糖钙的制备及其补钙功效研究

为优化海藻酸降解产生海藻酸单糖的制备工艺,本试验以海藻酸为原料,采用高温降解和H₂O₂氧化降解相结合的方法降解海藻酸,在单因素试验的基础上,通过正交试验确定海藻酸降解产生海藻酸单糖的最优条件。以废弃贝壳为钙源制备海藻酸单糖钙,并验证海藻酸单糖钙的补钙功效。正交试验结果表明,海藻酸降解的最优条件为:高温降解温度130℃、降解时间180 min、海藻酸与水质量比1:25,氧化降解温度92.5℃、降解时间150 min、海藻酸与30%H₂O₂比为1:5,此条件下海藻酸的降解率可达80.68%。当海藻酸单糖与水质量比为1:8、结合温度为30℃、反应时间为12 h时,海藻酸单糖与钙结合率达88.42%,含钙率为10.10%。薄层色谱分析及傅里叶变换红外光谱分析结果表明,海藻酸单糖的基本结构并未因高温及氧化降解发生变化。动物试验结果表明, 与低钙模型组相比,海藻酸单糖钙具有显著增加大鼠骨密度的作用(P<0.05)。本研究结果为海藻酸单糖的制备提供了新的方法,为海藻酸单糖钙成为功能性食品提供了基础数据,同时也为贝壳资源的高值化利用提供了一种新的方法。     

花生根部耐盐相关miRNAs的鉴定与功能分析

miRNAs作为一种基因表达调控子在植物应答胁迫的过程中起着重要的作用,当花生受到盐胁迫时,也会有相应的miRNAs参与基因表达调控应答胁迫。本研究对200份花生品种进行萌发期耐盐性鉴定,获得了高耐盐花生品种3份,中耐盐花生品种5份,盐高敏感品种4份。并对不同耐盐性花生品种在盐胁迫处理条件下进行了抗氧化酶活性(SOD,POD,CAT)和MDA含量的测定。结果表明,耐盐性花生品种清除活性氧的能力大于盐敏感型。盐胁迫条件下,耐盐性花生植株MDA含量较少,受到的伤害相对较小,而盐敏感植株的受伤害程度最大,也证明了耐盐性花生品种在受到盐胁迫伤害时植物体内存在更强大的保护作用。通过小RNA测序及对靶基因序列进行功能分析和同源序列功能检索,获得了8条花生耐盐相关保守miRNAs序列,miR159-1,miR159-2,miR159-3,miR164-2,miR167-3,miR319-1,miR319-2,miR2111-1。荧光定量PCR测定结果表明,这些花生保守miRNAs受盐胁迫诱导,并调控其靶基因的应答反应。     

条斑紫菜蛋白酶解多肽的抑菌活性

以条斑紫菜为原料,分别提取水溶、酸溶、碱溶、盐溶性蛋白质,并用6种蛋白酶酶解,将所得24种酶解物采用琼脂孔穴扩散法对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、四联微球菌(Micrococcus tetragenus)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)以及大肠杆菌(Escherichia coli)4种菌进行抑菌活性测定。结果显示,水溶性胃蛋白酶酶解物的抑菌活性最优。将水溶性蛋白质经硫酸铵沉淀以及超滤分级,比较不同饱和度硫酸铵沉淀所得蛋白质酶解物以及不同分子量多肽的抑菌效果。结果显示,水溶性蛋白在硫酸铵饱和度为40%、50%时沉淀所得蛋白的胃蛋白酶酶解物中,相对分子质量小于5 k Da的级分抑菌效果最为明显。此外,对该级分进行了抑菌活性影响因素的初步研究,结果表明该级分热稳定性以及酸碱稳定性均较好,有望开发为天然的食品防腐剂。     

酶解扇贝裙边制备复合氨基酸螯合钙的研究

扇贝裙边富含蛋白质、脂质等营养成分。为了高值化利用扇贝裙边,本研究选用中性蛋白酶、动物蛋白酶、风味蛋白酶、木瓜蛋白酶和酸性蛋白酶5种酶,以酶解液中游离氨基酸态氮为考察指标,对扇贝裙边进行酶解工艺条件探讨。首先,将5种酶制成复合蛋白酶进行正交实验,确定最佳酶解时间、温度、pH及加酶量,经检验,氨基酸转化率为77%;然后,通过实验确定CaCl2为最适钙源,以贝壳为原料,通过水飞法和酸法转化可制得贝壳源CaCl2。将扇贝裙边酶解液中复合氨基酸与来源于贝壳的钙螯合制备复合氨基酸螯合钙,以正交实验筛选出最佳螯合条件。经检验,该螯合反应螯合率达92%。     

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis) c-Jun基因的克隆及免疫应答分析

半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)AP-1家族转录因子c-Jun基因(Jun proto-oncogene)及其在免疫应答中的作用尚无报道.本研究根据半滑舌鳎转录组数据库中预测的c-Jun序列,通过RACE技术和PCR扩增方法获得了半滑舌鳎c-Jun基因cDNA全长2093 bp,CDS区域共981 bp,编码326个氨基酸,5'UTR区域377 bp,3'UTR区域735 bp.SMART分析显示,C-JUN蛋白具有2个结构域:AP-1家族典型结构域Jun,以及高度保守的亮氨酸拉链结构域(BRLZ).经蛋白多序列同源比对、系统进化树分析,发现半滑舌鳎c-Jun与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)c-Jun亲缘关系最近.实时荧光定量PCR分析显示,c-Jun基因在半滑舌鳎不同组织中普遍表达,在卵巢中表达量最高.鳗弧菌(Vibrio anguillarum)人工感染半滑舌鳎后,c-Jun基因在肝脏、脾脏、头肾、小肠、鳃、血液中表达量都出现不同程度上调,其中,鳃中变化最明显:感染12h后表达量达到0h时的13.20倍.使用LPS、PGN、PolyI:C和WGP病原模拟物刺激半滑舌鳎外周血淋巴细胞,结果显示,WGP诱导c-Jun基因上调表达,而LPS与PolyI:C均下调基因表达.以上实验结果表明,c-Jun基因在半滑舌鳎的免疫防御中发挥重要作用.