刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板,PCR扩增出16s-23s间隔区序列,将该片段克隆进pMD19-T Vector,转化大肠杆菌DH5a,获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物,合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性;探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测,其检出率均为100%。研究结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

几种消毒剂对养殖刺参"腐皮综合征"主要致病菌杀灭试验的研究

刺参“腐皮综合征”（俗称化皮病）是当前养殖刺参的最主要疾病,死亡率可达90%以上,属急性死亡,越冬保苗期幼参和养成期海参均可被感染发病。经研究证实,灿烂弧菌Vibriosplendidus和假交替单胞菌Pseudoalteromonas nigrifaciens是该病的主要致病原。作者通过漂粉精、溴氯海因、PVP-I、过氧化氢、双链季铵盐络合碘和生石灰6种消毒剂对灿烂弧菌和假交替单胞菌的定性杀灭实验发现,上述6种药物对腐皮综合征的病原菌都有明显的杀灭作用。     

养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性分析

为了解引起养殖大菱鲆(Scophthalmus maximus)腹水病的病原多样性及其耐药性情况,针对2002-2010年由不同地区病样分离的27株细菌性病原进行了16S rDNA鉴定,并采用K-B法测定了27株细菌对22种抗生素的耐药性,分析了病原菌的耐药谱及耐药率变化.结果显示,大菱鲆腹水病病原菌主要有大菱鲆弧菌(Vibrio scophthalmi)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、假交替单胞菌(Pseudoalteromonas espejiana).山东青岛地区以大菱鲆弧菌为主,威海地区以迟钝爱德华氏菌为主,烟台地区菌株种类分布平均.5类细菌对青霉素类、头孢菌素类、大环内酯类、复方新诺明耐药率高于50％.只有1株迟钝爱德华氏菌对氟苯尼考产生了耐药,其余菌株对其均没有耐药性,且在长期使用中不易产生耐药性,证实氟苯尼考为当前防治腹水病的一种良好抗菌药物.27株病原菌的耐药谱数量为27个,每个菌株具备自己独特的耐药谱,74.1％的菌株对10种以上的抗菌药物产生了耐药性,均有多重耐药性.     

中草药对刺参腐皮综合征病原菌的体外抑菌试验

用改良二倍稀释法和抑菌圈法测定了24种单方中草药和9种复方中草药对刺参腐皮综合征4种重要病原菌灿烂弧菌、假交替单胞菌、哈维氏弧菌和恶臭假单胞菌的体外抑菌活性。结果显示,不同中草药对特定病原菌抑菌效果差异较大,单方中草药最低抑菌浓度（MIC）为1.56mg/ml,中草药水煎剂H-5和H-9对假交替单胞菌的抑菌圈最大,达22mm。单方中草药中穿心莲、大青叶、金银花和川芎4种中草药对4株病原菌抑菌效果最好,其水煎剂对4株病原菌平均抑菌浓度分别为6.25、7.81、5.86和3.52mg/ml;平均抑菌圈直径分别是17.5、11.3、14.0和11.5mm。将筛选的4种单方中草药组成9种复方,复方MIC和抑菌圈均显著好于单方,最低MIC降低到0.20mg/ml。其中复方HC-G和HC-D抑菌浓度最低,效果最好,平均抑菌浓度分别降低为0.54和0.64mg/ml;平均抑菌圈直径分别为15.3mm和16.3mm。试验结果显示,复方最佳配比为穿心莲、大青叶、金银花和川芎=2∶1∶3∶2。该复方可为生产高效专用中草药,以替代抗生素,为刺参健康养殖提供技术保障。     

养殖大菱鲆蟹栖异阿脑虫病及其防治研究

对目前我国大菱鲆养殖过程中普遍发生的一种重要疾病———盾纤毛虫病的防治进行了较为全面地研究。描述了流行病学特征、病原形态学特点及分类地位,进行了主要环境因子对病原纤毛虫生存、生长的影响以及药物对纤毛虫的体外杀灭实验,并对实验室筛选的高效、低毒药物进行了临床治疗实验。研究结果表明,大菱鲆盾纤毛虫病的病原为蟹栖异阿脑虫(MesanophryscarciniGroliere&Leglise1977),属于广温、广盐、偏酸性食腐种类。多种药物对虫体的杀灭实验表明,甲醛、双氧水和复方中草药‘盾纤虫清’对该虫有较好杀除效果。甲醛溶液在3·1×10-5浓度下,7h可以杀死盾纤虫,双氧水在6·2×10-5浓度下,30min可杀灭虫体。另外,口服中草药‘盾纤虫清’(5g/kg饵料的添加量)显示出良好的治疗效果,为实际生产中防治盾纤虫病提供了理论依据。     

诺氟沙星在大菱鲆体内药代动力学及残留消除规律

利用高效液相色谱法分别测定了单次和多次混饲口灌大菱鲆诺氟沙星(NFLX)后鱼体主要组织中的NFLX含量。通过MCP-KP药动学程序对NFLX在大菱鲆体内的药代动力学及残留消除规律进行了分析研究。结果表明,以30mg/kg的剂量单次混饲口灌大菱鲆,NFLX在大菱鲆体内的达峰时间(Tmax)为2h,血、鳃、肾脏、肝脏、肌肉的达峰浓度(Cmax)分别为:8.365、7.519、1.871、6.485和4.060μg/g;NFLX在组织中的消除半衰期(T1/2)由小到大依次为:肝脏8.18h<肌肉12.39h<鳃丝15.29h<血液23.22h<肾脏23.25h。连续5d以30mg/kg的剂量混饲口灌大菱鲆,消除半衰期(T1/2)由小到大依次为:肌肉74.88h<血液98.16h<肝脏186.43h<鳃192.12h<肾脏200.45h。以上研究表明,诺氟沙星在大菱鲆体内的吸收较为迅速,有利于疾病的预防和治疗用药。在组织中以肾脏中的残留最为显著。使用诺氟沙星进行大菱鲆疾病的预防和治疗时,至少停药30d后方可上市销售。     

一种中草药复方对刺参苗期玻璃海鞘的杀除效果

用使君子、雷丸、茶籽饼、川楝子、大蒜素、矿物质分散剂组成中草药复方,分别以0、5、6、8、10、15、20和25 mg·L-1的浓度对刺参苗期玻璃海鞘(Ciona intestinalis)进行杀除效果和对刺参苗种的毒性试验,以研究中草药复方对海参苗期玻璃海鞘的杀除效果。结果表明:采用该中草药复方,浓度为10~15 mg·L-1时,药浴24 h,既能有效杀灭玻璃海鞘,又对稚参无毒副作用,对养殖水体各指标也基本无影响,是刺参养殖系统中杀灭玻璃海鞘的最适浓度。进一步的生产性应用实践表明,在刺参育苗池中采用“3+7”模式(用药后第3 d倒池、第7 d倒板)施用浓度10~15 mg·L-1的中草药复方,可达到杀除玻璃海鞘的良好效果,且与海参容易分离。在上述药物浓度作用下,刺参苗种伸展、附着和摄食正常,健康状况良好。该中草药复方适合在生产实践中应用推广。     

双氧水和甲醛在海水中的消解速率及其对水质因子的影响

采用显色法分别检测分析了甲醛、双氧水在海水中的消解速率,其最低检出限分别为0.25 mL/m<'3>和0.125 mL/m<'3>;同时研究了两种消毒剂加入海水中对水质因子的影响.结果表明:这两种消毒剂的消解速率与其使用浓度密切相关,使用浓度越高,在海水中的消解时间越长.甲醛浓度在100 mL/m<'3>时,48 h显示白浊,基本上降解消除;而当双氧水浓度在100 mL/m<'3>时,96 h仍有较高残留.由此得出,相同浓度甲醛的消解速率比双氧水快得多.在1 500 mL/m<'3>双氧水和600 mL/m<'3>甲醛极高浓度下,7 d后仍保持着很高的残留量.海水中加入甲醛,溶解氧、盐度、温度、pH均没有显著变化(P>0.05),而加入双氧水的海水,除了溶解氧提高以外(P<0.05),其它水质因子没有显著变化(P>0.05).建议在使用甲醛、双氧水时,应尽量避免使用高浓度剂量.同时应根据不同浓度双氧水、甲醛的药效作用和降解时间决定废水排放时间.也可敷设缓冲排放池,使消毒剂在海水中充分降解,防止过多的化学残留直接排放入海,破坏水域生态环境.这为正确使用双氧水和甲醛提供了理论依据和参考.     

养殖大菱鲆隐核虫病及其治疗

根据流行病学特征、病原形态、病理分析,确定了感染大菱鲆的寄生虫为刺激隐核虫,并进行了几种常用药物及自主研发复方中草药“HD-2”对刺激隐核虫的离体杀灭试验和临床治疗观察。结果表明,双氧水(H₂O₂)和复方中草药“HD-2”对该病有良好的杀灭和治疗效果。使用复方中草药“HD-2”,同时结合100～200 mL/m³的双氧水药浴,可达到迅速控制病情、病症消失的良好治愈效果。本项研究率先提出了复方中草药和双氧水可替代甲醛治疗隐核虫病的治疗方法,具有高效、低毒、低残留之优点,为有效防治隐核虫病提供了理论依据和技术支撑,对防止滥用化学药物、提高水产品质量和保护生态环境具有重要的现实意义。     

养殖大菱鲆黑瘦症的病原菌鉴定及杀菌中草药筛选

从患黑痩症的大菱鲆幼体内分离得到一株优势菌株,人工感染实验证实其为大菱鲆致病菌,并经过生理生化及16SrDNA序列分析鉴定为灿烂弧菌Vibrio splendidus。组织病理学显示,病鱼的肝脏、肾脏、脾脏、肠道及脑均呈现不同程度的组织破坏。用煎煮法提取11种常用中草药成分,测定该致病菌对中草药的杀菌效果。实验表明,五倍子和白头翁的杀菌效果最好,黄柏、穿心莲次之,当归、党参、杜仲、秦皮、金银花、乳香和没药的杀菌效果最差。以五倍子、白头翁为主要成分的初步治疗试验证明,药浴和口服给药可有效治愈大菱鲆苗期的黑瘦症。