基于形态性状和SSR标记的克氏原螯虾养殖群体遗传多样性分析

为客观评估广西南宁周边地区克氏原螯虾养殖群体的遗传多样性,采集来自南宁的3个克氏原螯虾群体——埃及群体（AJ）、良庆群体（LQ）和上林群体（SL）,以及湖北荆州（JZ）和江西湖口（HK）的群体各1个,采用形态学结合微卫星分子标记的方法分析其遗传多样性水平。形态分析结果显示,雌性群体的综合判别准确率为68.59%,雄性群体的综合判别准确率为73.60%;3个南宁群体（AJ,LQ,SL）与JZ群体聚为一类,3个南宁群体间具有较高的形态相似度。微卫星分析结果显示,AJ群体和LQ群体的遗传多样性最高,SL群体和HK群体次之;LQ群体与SL群体的遗传分化系数和遗传距离最小。结果表明广西南宁克氏原螯虾群体具有较高的遗传多样性,从国外引种或国内不同地理来源群体的杂交可能是提高克氏原螯虾群体遗传多样性的重要途径。     

无乳链球菌不同途径感染吉富罗非鱼后病原菌在体内的分布规律研究

为探讨无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)感染罗非鱼(Oreochromis spp)的致病途径。采用腹腔注射、灌胃和浸泡三种方式对吉富罗非鱼进行无乳链球菌(HN016菌株)胁迫感染,利用平板活菌计数法统计三种方式感染后病原菌在体内组织的分布。注射和灌胃两种方式感染后均出现典型的链球菌感染发病症状,其中注射组在感染24 h后出现死亡高峰,死亡率为92.5%;灌胃组感染48 h后出现死亡高峰,死亡率为90%;而浸泡组,感染后均没有出现明显的发病症状,也没有出现死鱼。注射组和灌胃组在感染后2 h,其脾脏、肝脏、前肾、胃、腮、皮肤和肌肉组织中均可分离出病原菌,5 h后在脑组织中均可分离出病原菌,8 h后各组织分离出的病原菌数达到峰值;而浸泡组在感染8 h后才从各组织中分离出病原菌,且它们的数量均低于同时期的注射组和灌胃组。注射和灌胃两种方式可使吉富罗非鱼快速感染无乳链球菌而发病,而浸泡方式感染后病原菌虽可以侵入机体,但不表现出症状。由此,我们推测在自然条件下养殖的罗非鱼是通过口腔采食携带无乳,链球菌的食物而被感染。     

西江流域卷口鱼线粒体D-loop序列的遗传多样性分析

为研究西江流域广西境内卷口鱼(Ptychidio jordani)种群的遗传变异情况,自广西境内6个江段采集了139尾样本,采用PCR与DNA测序技术分析其线粒体D-loop序列的遗传多样性及群体历史动态;139条D-loop序列长度均为725 bp,碱基组成A+T (65.7%)远远高于C+G (34.3%),共检测到变异位点25个,转颠换比R值为11.5。139尾样本共定义23个单倍型。单倍型的NJ系统树以及网络结构图显示,23个单倍型间有2个明显分支,不同地理群体来源的单倍型混杂分布在2个分支中,未能观察到明显的地理聚群。6个群体遗传多样性较好,单倍型多样性Hd=0.71585~0.92063,核苷酸多样性Pi=0.00173~0.00668,遗传分化极其显著(遗传分化系数Fst=0.36737,P<0.001)。AMOVA分析表明,群体内变异占63.26%,群体间为36.74%。中性检验(Tajima’s D= –0.50322,P=0.34600;Fu’s Fs= –5.05210,P=0.08800)与核苷酸错配分布表明,西江流域卷口鱼种群近期内未经历过种群扩张。综上所述,西江流域广西境内的卷口鱼遗传多样性表现为高单倍型、低核苷酸多样性的特征,群体间不同程度的遗传分化表明水坝阻隔及捕捞因素可能促进其发生,而水利梯级开发可能是促进卷口鱼群体遗传分化的首要原因。     

广西罗非鱼和卵形鲳鲹海豚链球菌的生化特性及基因多态性分析

对2006-2011年从广西养殖的罗非鱼Oreochromis niloticus和卵形鲳鲹Trachinotus ovatus中分离的链球菌菌株进行生理生化和二重PCR鉴定,并利用随机扩增多态性DNA标记( RAPD)对经鉴定为海豚链球菌Streptococcus iniae的临床菌株进行生化特性及基因多态性分析。结果表明：经鉴定共有22株临床分离菌株为海豚链球菌; RAPD分析发现,所有菌株的电泳结果均在750 bp处出现特异性条带,且带型相同;结合Bachrach的研究结果,推测本试验中所分离的22株海豚链球菌的血清型均为Ⅰ型。本研究结果可为防治鱼类海豚链球菌病提供科学依据。     

零换水条件下复合益生菌对罗非鱼生长性能、肌肉品质及养殖水体环境的影响

【目的】研究零换水条件下复合益生菌对罗非鱼生长性能、肌肉品质及养殖水体环境的影响,为渔 业节能减排与生态高效健康养殖提供参考。【方法】以罗非鱼为研究对象,在零换水条件下添加复合益生菌（试 验处理）开展罗非鱼养殖试验,以正常换水的养殖模式作为对照,进行罗非鱼生长性能、肌肉品质及主要水质指 标、细菌群落结构的对比。【结果】在零换水条件下,试验处理罗非鱼成活率为 83.3%,显著高于对照;饵料系 数 2.3,显著低于对照;肌肉品质方面,试验处理粗蛋白含 22.17%,显著高于对照。在整个养殖周期,试验处理 的主要水质指标维持相对稳定,水温为 26.5~30.5℃,pH 为 7.0~8.0,而亚硝酸盐为 0.039 mg/L,显著低于对照; 两组优势菌群相似,但试验处理菌群多样性指数高于对照。【结论】在零换水条件下,养殖水体中添加复合益生 菌提高了罗非鱼的成活率,降低了饵料系数,并在一定程度上改善了肌肉品质,并对养殖水环境具有改善作用, 菌群多样性指数提高,在整个养殖生产周期内对常规养殖模式依靠频繁换水释放环境压力的替代作用良好。     

凡纳滨对虾CTNNBL1基因克隆及表达分析

[目的]明确CTNNBL1基因在凡纳滨对虾抗病过程中的功能作用,为深入探讨对虾抗病免疫机制提供参考依据.[方法]采用RACE-PCR克隆凡纳滨对虾CTNNBL1基因(LvCTNNBL1),利用在线软件进行生物信息学分析,并进一步分析其组织表达特征及应答白斑综合征病毒(WSSV)和副溶血弧菌感染的表达模式.[结果]LvCTNNBL1基因cDNA全长1906bp,其中开放阅读框(ORE)长1692 bp,编码563个氨基酸,含有1个CTNNBL结构域.同源性分析发现LvCTNNBL1蛋白与大型溞(Daphnia magna)同源蛋白的相似度最高,为77%.基于CTNNBL1基因序列的系统发育进化分析结果显示,凡纳滨对虾被聚为无脊椎动物一类,与同为节肢动物的大型溞、西方蜜蜂(Apis mellifera)和美洲鲎(Limulus polyphemus)的亲缘关系较近.LvC TNNB L1基因在凡纳滨对虾中呈组成型表达,以在肠道中的表达量最高、表皮中的表达量最低.注射感染WSSV后,LvC TNNB L1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先下降后上升趋势,在所有检测时间点与对照组间存在显著(P<0.05)或极显著(P<0.01,下同)差异;注射感染副溶血弧菌后,LvCTNNBL1基因在凡纳滨对虾血细胞中的表达量呈先上升后下降趋势,感染后12h内较对照组极显著升高.[结论]LvCTNNBL1基因表达量在病毒和细菌感染时发生明显变化,可能参与了凡纳滨对虾的抗病免疫途径.     

卵形鲳鲹生长抑素家族基因的全基因组鉴定及组织表达特征分析

【目的】明确卵形鲳鲹生长抑素（SST）家族基因的种类及其组织表达特征,为进一步揭示SST家族基因在其生长发育过程中的作用机制打下基础。【方法】采用HMMER 3.1对卵形鲳鲹全基因组数据进行搜索,然后通过Pfam、SMART及NCBI CDD等数据库确认搜索获得的基因是否属于SST家族基因;采用ProtParam和PSORT等在线软件进行生物信息学分析,并以实时荧光定量PCR检测SST家族基因在卵形鲳鲹不同组织中的表达情况。【结果】从卵形鲳鲹全基因组中共鉴定出4个SST家族基因（SST1、SST3、SST5和SST6）,分别编码122、127、106和110个氨基酸残基,对应的编码蛋白分子量介于12249.3~14316.1Da,理论等电点（pI）介于6.51~7.43,均定位于细胞外。4个卵形鲳鲹SST基因结构较简单且相似,均包含2个外显子和1个内含子;SST1和SST3基因位于7号染色体上,SST6和SST5基因则分别位于8号和23号染色体上;4个卵形鲳鲹SST氨基酸序列相似性的平均值为33.42%,以SST5氨基酸序列与SST6氨基酸序列的相似性最高（39.78%）,SST3氨基酸序列与SST5氨基酸序列的相似性最低（28.16%）。SST家族基因在卵形鲳鲹脑、胃、性腺和肌肉等组织中均有不同程度的表达,SST1、SST3和SST6基因在脑组织中显著高表达（P<0.05,下同）,而SST5基因在性腺和肌肉组织中显著高表达;此外,SST3、SST5和SST6基因在卵形鲳鲹卵巢中的相对表达量均显著高于在精巢中的相对表达量。【结论】从卵形鲳鲹基因组中鉴定出4个SST家族基因（SST1、SST3、SST5和SST6）,其表达分布存在组织特异性和种属特异性,可能介导卵形鲳鲹的神经调节、性腺发育及性二型性等多种生理功能,且不同物种的SST基因功能可能存在差异。     

基于dnaJ基因的弧菌PCR检测方法

[目的]建立一种能扩增dnaJ基因全长的PCR检测方法,为弧菌的快速筛查及种类鉴定提供技术支持.[方法]以弧菌dnaJ基因为靶基因,在其首尾的保守区域设计一对简并引物,经优化退火温度和引物浓度,建立能扩增弧菌接近全长dnaJ基因的PCR检测方法,并通过特异性试验、灵敏度试验和临床应用评价等验证其适用性.[结果]优化后的PCR反应体系50.0 μL:2×F8 FastLong PCR MasterMix 25.0 μL,上、下游引物(20 μmol/L)各2.0 μL,DNA模板5.0 μL,灭菌水补足至50.0 μL.扩增程序:94℃预变性3 min;94℃ 10 s,55℃ 15 s,72℃ 15 s,进行35个循环;最后72℃延伸5 min.该PCR检测方法对副溶血弧菌、哈氏弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、溶藻弧菌、拟态弧菌、霍乱弧菌和栖黑海弧菌等8种弧菌属细菌具有很强的特异性,对弧菌的最低检出限为102CFU/mL.应用建立的PCR检测方法对51株分离自海水样品的弧菌和32株分离自对虾样品的弧菌进行检测,结果显示全部为阳性,其中,海水样品中包括有副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌、哈氏弧菌和栖黑海弧菌,对虾样品中包括副溶血弧菌、溶藻弧菌、创伤弧菌、河流弧菌和哈氏弧菌;经测序及同源性比对分析发现,种间菌株的dnaJ基因序列相似度为79.5%~92.8%,种内菌株间的dnaJ基因序列相似度为98.2%~99.9%.[结论]基于dnaJ基因建立的弧菌PCR检测方法能扩增出弧菌接近全长dnaJ基因,具有快速便捷、灵敏准确、适应性好等优点,结合测序技术,可为弧菌快速筛查及种类鉴定提供更全面和更准确的技术手段.     

基于线粒体Cyt b基因的南海北部金钱鱼种群遗传结构分析

【目的】分析南海北部金钱鱼（Scatophagus argus）遗传多样性,明确其群体演化历史和分布动态,为金钱鱼养殖育种及其种质资源的合理开发利用提供科学依据。【方法】以采自福建东山（DS）、广东阳江（YJ）、海南海口（HK）、广西北海涠洲岛（BH）、广西钦州（QZ）、广西防城港（FC）及越南清化（TH）等南海北部的7个金钱鱼地理群体为研究对象,基于线粒体DNA细胞色素b基因（Cyt b）序列分析,利用DnaSP 5.10统计南海北部金钱鱼群体的单倍型、单倍型多样性指数（H_d）和遗传多样性指数（π）,通过邻接法（NJ）构建单倍型的系统发育进化树,以Network 4.6中的中介连接网络法构建单倍型网络图,并综合Tajima’s D检验、Fu’s Fs检验及核苷酸错配分布等方法分析金钱鱼群体的历史动态。【结果】7个金钱鱼地理群体的291条Cyt b基因序列定义为33个单倍型（Hap1~Hap33）,其中单倍型Hap1、Hap2和Hap7是南海北部金钱鱼在长期进化过程中形成的稳定优势基因型。7个金钱鱼地理群体的H_d为0.54103~0.77436,π为0.00112~0.00171,群体内遗传距离为0.00113~0.00171,遗传分化系数（F_st）为-0.01734~0.00364,基因流（Nm）为137.03888~inf。不同地理群体的单倍型均无规律地散布在单倍型系统发育进化树上,不存在与地理群体明显对应的系统分支,也未表现出明显的地理聚群分布特征。金钱鱼群体内个体间的遗传变异为100.74%,说明遗传变异全部来源于群体内个体间,即南海北部金钱鱼群体既无群体分化,也无以琼州海峡分隔的组群分化。Tajima’s D检验和Fu’s Fs检验结果均为显著负值,且核苷酸错配分布呈单峰分布,推测南海北部金钱鱼群体发生过群体扩张,且扩张事件约发生在3.4万年前,属于更新世晚期。【结论】南海北部7个金钱鱼地理群体的遗传多样性符合高单倍型多样性低核苷酸多样性类型,群体间遗传距离较小,亲缘关系较近,遗传分化不明显,且群体间存在频繁的基因交流,具有高度的遗传同质性,符合南海北部金钱鱼是一个随机交配种群的假设。