用免疫蛋白质组学方法筛选哈氏弧菌免疫反应蛋白

用免疫蛋白质组学的研究方法鉴定了哈氏弧菌的免疫反应蛋白。将哈氏弧菌接种于TSB培养基28℃培养18h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,一向电泳采用7cmpH4～7的胶条进行等电聚焦,二向用12.5%的SDS-PAGE胶分离蛋白质,考马斯亮蓝染色,获得双向电泳图谱,再结合免疫转印技术检测免疫反应的蛋白质,利用ImageMaster 2D Platinum进行配对分析得到15个非特异性的免疫反应性蛋白点,30个特异性的免疫反应性蛋白点。经过鉴定得到13种非特异性的免疫反应性蛋白质,这其中有2对蛋白在胶上的位置不同,但鉴定为同一种蛋白;同时得到28种特异性的免疫反应性蛋白质,有一个蛋白点没有在数据库中查找到相对应的蛋白质,还有1对蛋白在胶上的位置不同,但鉴定为同一种蛋白。将特异性免疫反应蛋白鉴定结果与非特异性比较发现有1对蛋白鉴定为同一种蛋白;另外,No.17和No.19是F0F1 ATP synthase的两个亚基。特异性免疫反应蛋白鉴定结果中有6个蛋白质是已知的其他细菌的具有免疫反应的蛋白,分别为OmpN,OmpW,OmpU,alanine dehydrogenase,Elongation factor...     

溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB的原核表达及条件优化和纯化

为研究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus) HY9901转运蛋白TolB作为疫苗候选抗原的可能性,根据已发表的溶藻弧菌HY9901转运蛋白TolB序列(JQ846501),设计1对带酶切位点的引物,PCR扩增tolB基因,然后经酶切、连接等步骤,构建tolB基因的原核表达载体pET-TolB,并对其IPTG浓度、诱导时间、温度、洗脱浓度进行优化,以期获得较大量的目的蛋白。结果表明：IPTG诱导后经SDS-PAGE与Western-blot分析,成功表达了溶藻弧菌HY9901株TolB蛋白,分子量与预期相符,且表达的蛋白以包涵体的形式存在;TolB蛋白在大肠杆菌中诱导表达的优化条件为：0.2 mmol/L IPTG,37℃诱导4 h;最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol/L。这些结果为进一步研究目的蛋白的免疫原性和疫苗制备奠定基础。     

罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910转录调控因子rovS基因的克隆及表达研究

为了对罗非鱼源无乳链球菌ZQ0910株毒力相关转录调控因子rovS进行克隆及表达研究,实验根据GenBank上登录的相关基因设计引物,采用PCR方法扩增该株细菌的rovS基因,然后将该基因定向克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行IPTG诱导表达.结果显示,该基因有849个碱基,编码282个氨基酸;同源基因序列比对显示,无乳链球菌ZQ0910株与无乳链球菌2603 V与ATCC13813的rovS基因的同源性最高;经IPTG诱导后表达的融合蛋白分子量为34 ku;用亲和层析后的融合蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,经ELISA检测效价达到1∶512000.研究结果表明,实验成功克隆与表达了rovS基因,为深入探讨RovS调节因子在调节细菌的代谢、生长和毒力等多种生命活动中的作用提供了理论依据.     

溶藻弧菌全菌可溶性蛋白二维图谱的建立及部分蛋白分子的鉴定

本研究采用蛋白质组学技术,建立了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03培养至稳定期的蛋白质组双向电泳图谱,并对部分蛋白分子进行了肽质量指纹图谱分析鉴定。首先将溶藻弧菌接种于TSB培养基28℃培养24 h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,荧光染料标记,24 cm pH4 ～ 7的胶条进行等电聚焦,再用12.5%的胶进行SDS-PAGE。2-D胶经过分析,得到902±8个蛋白斑点,重复胶的匹配点数为866±28,匹配率为96%。从双向电泳图谱中选取68个高丰度蛋白质点进行肽质量指纹图谱鉴定,其中60个在NMPDR数据库中得到鉴定,另外8个在NCBI数据库中得到鉴定。鉴定的蛋白中发现Serine protein kinase、purine nucleoside phosphorylase 和Alkyl hydroperoxide reductase subunit C-like protein存在修饰现象,它们在胶上均有2种表现形式。对68个蛋白进行了细胞功能的分类,发现能量代谢蛋白最多,占43%;其次是转运和结合蛋白,占9%;第三是外膜蛋白,占8%。经CMR操纵子预测软件分析预测到2个操纵子,它们均参与了能量代谢过程。研究结果为溶藻弧菌在不同生长条件下的比较蛋白质组学以及该菌强毒株和无毒株的比较研究提供了基础资料。     

南极硅藻GJ01谷胱甘肽合成酶法生产谷胱甘肽

以南极微藻中的南极硅藻GJ01(Berkeleya rutilansGJ01)为材料,采用分光光度法研究谷胱甘肽的前体氨基酸等因子对谷胱甘肽合成酶的影响,并在少量可供应ATP的南极硅藻GJ01细胞存在的情况下,对其游离谷胱甘肽合成酶合成谷胱甘肽的条件进行优化。结果表明,南极硅藻GJ01谷胱甘肽合成酶的最适温度为10～25℃,最适pH值为7.0;Glu、Cys、Gly的最适浓度分别为24 mmol.L-1、12 mmol.L-18、mmol.L-1。此外Met对谷胱甘肽的合成也有影响,而且南极硅藻GJ01的谷胱甘肽合成酶还具有Mg2 依赖性。正交实验表明,南极硅藻GJ01游离谷胱甘肽合成酶,产生谷胱甘肽的最理想条件为,温度30℃、Cys浓度10 mmol.L-1、Mg2 浓度30 mmol.L-1、pH 7.5。该方法用于工业化生产谷胱甘肽是可行的。     

表面活性剂SDS与DBS对褐点石斑鱼急性毒性研究

[目的]研究表面活性剂SDS和DBS对水环境的污染程度,分析比较2类毒性数据处理方法的优劣。[方法]以褐点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)变态期仔鱼作为指示生物,采用静水法生物测试研究SDS和DBS的急性毒性。建立直线回归模型,并用非线性最小二乘拟合技术构建非线性回归模型,预测表面活性剂的毒性效应。[结果]2种表面活性剂的直线方程F检验均为极显著;其剂量—效应曲线(DRC)均可用双参数模型Weibull与Logit函数有效表征。直线和非线性回归模型对2种表面活性剂毒性效应估算表明,预测半致死浓度时,2种模型差异可忽略不计;预测极端效应浓度时,差异显著。直线回归模型估算的安全浓度SDS为0.4292mg/L,DBS为0.9543mg/L;双参数模型对48hLC50拟合预测值SDS为1.5033mg/L,DBS值为3.3416mg/L,两者预测结果一致,毒性均为SDS大于DBS。[结论]试验结果为研究表面活性剂污染对水环境造成的危害及评价提供参考资料,并为毒性数据的分析处理提供一种可供参考的新模式。     

十二烷基苯磺酸钠对奥尼罗非鱼免疫毒性的研究

用5种浓度的十二烷基苯磺酸钠（sodium dodeeyl benzene sulfonic,SDBS）浸泡刺激奥尼罗非鱼（Tilapianilotica♀×raurea♂）8周,每2周采血样1次,测定免疫指标。0．05和0．10mg·L^-1组对奥尼罗非鱼的氯化硝基四氮唑兰（nitro blue tetrazolium,NBT）阳性细胞和IgM含量无影响。0．40mg·L^-1组在第8周时,IgM含量显著下降,而NBT阳性细胞突然急剧下降,与对照组相比差异极显著。0．70mg·L^-1组从第4周起,NBT阳性细胞和IgM含量开始减少,第6周时差异显著。1．00mg·L^-1组NBT阳性细胞数在第2周时量就已经有减少,但与对照组相比差异不显著,到第4周时差异极其显著;在第4周时IgM含量有显著差异,第6周后差异极显著。攻毒试验表明,0．40、0．70和1．00mg·L^-1组的死亡率均高于对照组。以上结果表明,当SDBS浓度大于0．40mg·L^-1时,奥尼罗非鱼免疫功能不同程度受到抑制,对NBT阳性细胞和IgM的影响存在着时间与剂量效应。     

罗非鱼源无乳链球菌溶血素基因体外表达及其免疫原性

为研究罗非鱼源无乳链球菌溶血素(Hemolysin,Hly)对鱼体的免疫保护作用,根据已获得的无乳链球菌ZQ0910全基因组序列设计引物扩增hly基因,定向克隆于原核表达载体p ET-28a中,构建原核重组质粒p ET-28a-hly,经IPTG诱导表达后,制成亚单位疫苗免疫吉富罗非鱼,并分析疫苗的免疫保护力。结果显示,hly基因产物大小1335 bp,编码444个氨基酸,经测序与Gen Bank报道的链球菌属Hly氨基酸序列同源性可达99%。经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE分析可见一条51.7 k D的特异条带;Western blotting分析结果说明表达的Hly蛋白能与His-Tag单抗特异性结合;制备的亚单位疫苗免疫鱼体后第14天即可检测到抗体产生,并在第28天达到峰值,抗体效价为1∶4096,免疫保护率为70%。由此证实,该亚单位疫苗有望成为预防由无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病的基因工程类疫苗。     

饲料中添加沼泽生红冬孢酵母对凡纳滨对虾消化酶及肠道微生物的影响

在基础饲料中分别添加沼泽生红冬孢酵母干酵母和活酵母,在水温(26.2±1)℃、pH 7.4～8.0、盐度5条件下,进行为期6周的养殖试验.研究沼泽生红冬孢酵母对凡纳滨对虾肝胰腺消化酶和肠道微生物的影响.结果表明,饲料中添加干酵母,能显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中蛋白酶和脂肪酶活性(P<0.05);添加活酵母,能显著提高蛋白...     

虎纹蛙烂趾病病原菌分离鉴定与药敏试验

从息典型烂趾病的虎纹蛙病灶组织分离到1株细菌.暂命名为WD-01,经人工感染证实该细菌为虎纹蛙烂趾病的病原菌.通过形态学、生理生化特性对其进行鉴定,并用纸片法进行药敏试验.鉴定结果表明,细菌WD-01为嗜水气单胞菌.药敏试验结果表明,新霉素、利福平、先锋霉紊、诺氟沙星、庆大霉素、强力霉素、链霉素、卡那霉素、土霉素和金霉素等12种药物对菌株WD-01具有明显的抑制作用.