坛紫菜泛素连接酶PhCUL1基因克隆与功能验证

高温影响坛紫菜(Pyropia haitanensis)的产量和品质,是制约紫菜产业发展的主要因素。前期研究发现,高温胁迫下,坛紫菜泛素蛋白酶体系统相关基因显著上调表达,但其响应高温胁迫的分子功能还未知。本研究通过分子生物学、遗传学等技术手段对坛紫菜cullin E3连接酶基因(PhCUL1)的功能进行研究。利用PCR方法克隆了PhCUL1基因的全长,PhCUL1全长为2500 bp,开放阅读框(ORF)长度为2481 bp,该基因存在1个Cullin (407~618 aa)结构域和1个Cullin Nedd8 (754~821 aa)结构域,其中,Cullin Nedd8结构域为蛋白融合位点。进化树分析显示,PhCUL1在进化上与脐形紫菜(Porphyra umbilicalis)有较近的亲缘关系。qRT-PCR结果显示,PhCUL1基因被高温显著诱导。为进一步阐明PhCUL1的分子功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)进行功能验证,过表达PhCUL1株系比野生型更能耐受高温胁迫。同时,在高温33℃下处理3 h和6 h内,转基因植株的PhCUL1基因呈上调表达。这初步说明PhCUL1基因在坛紫菜响应高温胁迫过程中发挥着重要作用,其具体调控机制有待进一步研究。本研究有助于阐明坛紫菜泛素蛋白酶体系统响应高温胁迫的分子机制,为指导耐高温新品种选育提供理论依据。     

水产动物肌酸营养的研究进展

肌酸(creatine,Cr)又称为N-甲基胍乙酸或肌肉素,是一种含氮有机酸。已广泛应用于改善人类健康,尤其用于促进肌肉生长。本文综述了肌酸在动物体内的合成、转运和储存规律,以及肌酸在肌肉和肝脏能量代谢中的作用,分析了饲料补充肌酸对动物生长和屠宰性能的影响,并从肌肉pH、系水力和肉色角度综述了肌酸对肉品质影响的研究进展,最后对肌酸在水产动物中的应用前景进行了展望,以期为肌酸在水产动物营养中的研究和在饲料中的应用提供参考。     

棘头梅童鱼中期染色体物理长度的估测

棘头梅童鱼（Collichthys lucidus）是我国重要的海洋经济鱼类之一,具有特别的多性染色体系统（X1X1X2X2/X1X2Y)。本研究使用流式细胞术（flow cytometry,FCM）首次估测了棘头梅童鱼基因组的大小,并利用碘化丙啶染色与图像分析软件测定棘头梅童鱼24对染色体的相对面积、相对长度以及相对累积荧光强度,估算了染色体的物理长度。结果显示,雌性和雄性棘头梅童鱼的基因组大小分别为802.91 ± 2.19 Mb和786.52 ± 1.95 Mb。雌性基因组显著大于雄性基因组（约16.39 Mb）。雌性的核型公式为2n = 48 = 48t,臂数NF = 48, 染色体估测物理长度在（22.17 ± 0.72） Mb ~ （46.30 ± 1.06） Mb之间。雄性的核型公式为2n = 47 = 1m + 46t,臂数NF = 48。其中,雄性特有的m染色体为Y染色体,其估测物理长度为（62.95 ± 2.89 ）Mb。染色体的估测物理长度与相对面积、相对长度均成正线性相关。研究结果为棘头梅童鱼染色体的识别、配对提供更丰富的信息,为棘头梅童鱼Y染色体的组装及石首鱼科鱼类染色体进化提供参考数据。     

坛紫菜转录因子NhbZIP1克隆和功能验证

高温是制约坛紫菜(Neoporphyra haitanensis)产业发展的主要因素之一,阐明坛紫菜高温胁迫应答机理对耐高温品种选育至关重要。人们已分离多个坛紫菜抗逆相关基因,但尚不清楚这些基因的表达调控机制。本研究通过分子生物学和生物信息学技术分离了坛紫菜转录因子NhbZIP1基因。该基因开放阅读框长825 bp,编码274个氨基酸。从开放阅读框推导的氨基酸序列有5个低复杂度区域和1个BRLZ结构。其中,BRLZ是bZIP家族的保守结构域,含有一个α卷曲螺旋结构(121~171 aa)。实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测发现,NhbZIP1受高温胁迫显著诱导。为进一步阐明NhbZIP1的功能,将其转入莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中。结果显示,高温胁迫下转基因藻株生物量始终高于野生型,且随处理时间增加差异越来越显著。转基因藻株中热激蛋白家族和抗氧化系统相关基因的表达量显著高于野生型。研究表明,NhbZIP1激活下游抗逆基因表达,在坛紫菜应答高温胁迫中发挥重要作用。研究结果有助于阐明bZIP调控坛紫菜响应高温胁迫的分子机制,为耐高温新品种选育提供了基础信息。     

四种鲍45S rDNA在染色体上的比较定位

为了研究皱纹盘鲍、西氏鲍、绿鲍和杂色鲍等4种鲍的核型特征,实验利用荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)技术比较定位了上述4种鲍的45S rDNA位点。皱纹盘鲍中约83%的中期细胞均检出2对45S rDNA位点,分别位于13号和16号染色体的长臂端部。西氏鲍中约75%的中期细胞均检出3对45S rDNA位点,分别位于6号染色体短臂端部、14号和17号染色体长臂端部。绿鲍中约85%的中期细胞均检出3对45S rDNA位点,分别位于4号、6号和8号染色体长臂的端部。杂色鲍中约65%的中期细胞均检出3对45S r DNA,位点,分别位于3号、4号和12号染色体短臂的端部。此外,4种鲍均有少数中期相的45S rDNA位点数高于众数,这提示,除了明确的45S rDNA位点外,4种鲍可能均有若干个不稳定的45S rDNA位点。实验结果丰富了鲍细胞遗传学研究资料,同时为鲍的遗传育种研究提供了基础数据。     

基于CRISPR/Cas9系统构建青鳉突变体

青鳉是研究基因功能、器官发生和发育机制的模式生物之一,基因编辑技术已在青鳉中得到广泛应用,但利用CRISPR/Cas9技术构建青鳉突变体的详细过程还未见报道。为了完整详细地阐明青鳉突变体的构建过程,实验以青鳉Olpax6.1基因的敲除为例,首先利用ChopChop 网站设计获得 Olpax6.1基因gRNA的靶点;其次通过PCR扩增和质粒酶切分别获得gRNA和Cas9 mRNA体外转录的模板,并通过体外转录合成gRNA和Cas9 mRNA;再将Cas9 mRNA和gRNA混合进行青鳉胚胎显微注射获得突变F₀;最后利用PCR、T7 Endonuclease Ⅰ酶切和Sanger测序筛选F₀与野生型杂交的子代获得相同突变类型的F₁,进而将相同突变的F₁进行杂交并筛选其子代,获得青鳉 Olpax6.1 敲除的纯合突变体,纯合突变体表现出眼部发育畸形的经典表型。本研究为青鳉突变体的构建提供详细完整的实验方案,同时也为其他鱼类突变体的构建提供技术参考。     

脱脂黑水虻虫粉替代鱼粉对大黄鱼幼鱼生长、体成分、血清生化指标及抗氧化能力的影响

本实验旨在探讨脱脂黑水虻(Hermetia illucens)虫粉(DBSFLM)替代鱼粉(FM)对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼生长、体成分、血清生化指标及抗氧化能力的影响。实验设计6组等氮(粗蛋白45%)等脂(粗脂肪10%)饲料,用黑水虻脱脂虫粉分别替代饲料中0%、20%、40%、60%、80%和100%的鱼粉蛋白,分别记为G0、G20、G40、G60、G80和G100。选用2160尾平均体重为(50.08±3.31)g的大黄鱼幼鱼随机分为6组,每组3个重复,每个重复120尾,在室内水泥池(2 m×1 m×1 m)进行为期7周的投喂实验。结果表明:(1) G100组大黄鱼幼鱼存活率显著低于其他实验组, G40组大黄鱼增重率(WGR)、蛋白质效率(PER)均显著高于其他组(P0.05);(2)大黄鱼肌肉粗蛋白含量随着DBSFLM替代FM水平的增加而下降,替代40%及以上鱼体粗蛋白含量显著降低(P0.05);肌肉的粗脂肪和粗灰分含量则随DBSFLM替代FM水平的增加而升高,其中替代60%及以上鱼体粗脂肪和粗灰分含量显著升高(P0.05);(3)随着替代水平的升高(40%),大黄鱼血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性显著上升(P0.05),甘油三酯(TG)和胆固醇(CHOL)水平显著下降(P0.05);(4)G20组大黄鱼肝脏总抗氧化能力(T-AOC)及G40组实验鱼肝脏超氧化物歧化酶(SOD)活性均为最高,G40组大黄鱼肝脏丙二醛(MDA)含量最低。过氧化氢酶(CAT)活性随着DBSFLM替代FM水平升高呈现下降趋势,替代40%及以上CAT活性显著下降(P0.05)。综上所述,在本实验条件下,脱脂黑水虻虫粉替代饲料中40%鱼粉蛋白对大黄鱼幼鱼的生长性能、体成分及健康状况无负面影响。     

luxR基因调控嗜水气单胞菌耐药性的分子机制初探

LuxR家族蛋白是一类在革兰氏阴性细菌中发挥重要作用的调控蛋白,参与细菌多项重要生理活动。采用RNAi技术构建嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila) luxR05735稳定沉默菌株luxR05735-RNAi,并利用qRT-PCR检测基因沉默效果。结果显示,与野生株相比,沉默株中luxR05735的表达量降低了96.8%。药物敏感性实验表明,与野生株相比,luxR05735-RNAi对庆大霉素、诺氟沙星、卡那霉素、吡哌酸的耐药性显著降低。对野生株与沉默株luxR05735-RNAi的转录组数据进行分析发现,表达差异显著的基因共有1286个,其中,上调基因353个,下调基因933个;显著富集的通路4条,分别是核糖体通路、精氨酸生物合成通路、硫代谢通路、硒化合物代谢通路;在这4条通路中可能与嗜水气单胞菌耐药性相关的重要功能基因包括metE、glnA、rplB、rplX、rpsA、rpsJ等,这些功能基因编码的蛋白主要与细菌的生物成膜及核糖体蛋白合成相关。综合以上研究结果,可以推测嗜水气单胞菌的luxR05735通过调控细菌的生物膜形成相关基因及核糖体蛋白相关基因的表达,从而调控细菌对药物的耐受性。