刺参响应灿烂弧菌侵染差异microRNAs鉴定及靶基因分析

microRNA参与基因的转录后调控,在真核生物的生长发育、细胞分化和免疫防御等过程中发挥重要作用。刺参(Apostichopus japonicus)病害问题已成为产业发展的主要限制因素之一,而其病害发生的分子机制尚待进一步完善。本研究以刺参重大疾病“腐皮综合征”的重要致病原灿烂弧菌(Vibrios splendidus)为侵染菌株,通过人工侵染实验制备患病刺参样本,采用miRNA-seq技术对侵染组(PT16S)和对照组(PT10H)各3头刺参的体壁组织进行miRNA测序,通过相关生物信息学软件对miRNAs进行鉴定和分析,筛选差异表达miRNAs (DEmiRNAs)并预测其靶基因,构建关键调控途径的miRNA-mRNA调控网络。结果显示,PT10H组平均得到5 902 588条有效序列,194个已知miRNA和19个新的miRNA;PT16S组平均得到5 053 529条有效序列,182个已知miRNA和42个新的miRNA。对2组鉴定到的miRNA进行差异表达分析,共筛选到2个上调和11个下调的具有显著差异的DEmiRNAs (P≤0.05),上调的DEmiRNAs靶基因预测结合到3010个靶基因,注释到585个GO terms及24条信号通路(P≤0.05),下调的DEmiRNAs靶基因预测到19 072个靶基因,注释到514个GO terms以及22条信号通路(P≤0.05)。对筛选到的DEmiRNAs进行实时荧光定量PCR (qRT-PCR)验证,显示miRNA-seq与qRT-PCR的一致率达到70%。根据KEGG分析结果构建泛素介导的蛋白水解途径和Notch信号通路的miRNA-mRNA调控网络,结果显示,13个DEmiRNAs分别靶向结合134个与泛素介导的蛋白水解相关的mRNAs和109个与Notch信号通路相关的mRNAs,Aja-miR-184、Aja-miR-2478和Aja-miR-9277p等DEmiRNAs可能参与对Notch信号通路和对泛素介导的蛋白水解的调控。相关研究结果将为刺参疾病发生调控网络建立和机制解析提供依据。     

凡纳滨对虾工厂化循环水养殖系统水质指标及微生物菌群结构的分析

为探究凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)工厂化循环水养殖系统的养殖水体水质情况以及微生物菌群的组成结构,本研究利用高通量测序技术和生物信息学分析手段,测定凡纳滨对虾工厂化循环水养殖过程一级移动床生物净化、二级固定床生物净化、养殖水体的水质指标、水体和生物净化载体以及对虾肠道微生物菌群的组成。结果显示,水体的氨氮(NH4+-N)和亚硝态氮(NO2–-N)质量浓度显著降低,分别为0.85和0.21 mg/L。养殖系统水体、生物净化载体和虾肠道样品中共有的优势菌为变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes),此外,一级、二级生物净化系统水体中的放线菌门(Actinobacteria)为优势菌,生物净化载体中浮霉菌门(Planctomycetes)和硝化螺旋菌门(Nitrospirae)为优势菌;对虾肠道中的厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌。另外,对虾养殖循环水系统中生物净化载体上的细菌物种含量比水样中的细菌物种少,但微生物多样性高于养殖水体,生物净化载体中微生物具有低丰度和高多样性的特点。综上所述,生物净化系统可有效地增加水体中促进氮、磷代谢的微生物菌群,调控养殖水体的水质指标,研究结果为凡纳滨对虾工厂化循环水养殖系统构建及水质调控提供理论依据。     

斑石鲷irf7基因克隆及其在病毒感染下的表达

为探究斑石鲷(Oplegnathus punctatus)干扰素调节因子irf7在虹彩病毒(Iridovirus)感染过程中的作用机制,本研究通过PCR扩增获得了斑石鲷irf7基因CDS区序列,对其序列特征进行分析,并在组织水平和细胞水平研究该基因在病毒感染中的表达模式。结果显示,Opirf7基因CDS区全长为1332 bp,编码443个氨基酸的多肽,具有干扰素调节因子家族的保守结构域。荧光定量PCR (qRT-PCR)结果显示,Opirf7基因在健康个体的不同组织中均有表达,在肝脏中表达量最高,在皮肤和肠等免疫组织中的表达量也较高。对斑石鲷腹腔注射虹彩病毒诱导抗病毒免疫反应,在组织水平检测Opirf7对病毒感染的响应模式。与对照组(0 h)相比,Opirf7在免疫组织中的表达水平有不同程度的升高。在细胞水平,建立poly I: C感染的斑石鲷脑细胞系模型,利用qRT-PCR检测Opirf7的表达变化。结果显示,poly I: C刺激后,脑细胞系Opirf7的表达量显著升高。结果表明,Opirf7在斑石鲷抗病毒病的免疫应答过程中发挥重要作用。     

基于原位LAMP技术的牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)易感宿主调查

牡蛎疱疹病毒(Ostreid herpesvirus 1, OsHV-1)给世界双壳贝类养殖业造成了严重的经济损失。10余种双壳贝类陆续被认定为易感宿主,仍有其他几种贝类仅有PCR核酸阳性数据,因确诊证据不足导致其易感性未得到充分评估。原位环介导等温核酸扩增(LAMP)检测技术相对传统原位杂交技术具有灵敏度高、方便快捷、可作为病原微生物感染证据的优点。为了在OsHV-1流行病学调查过程中实现病毒感染的快速检测和确诊,根据已报道的OsHV-1特异性LAMP检测引物,设计内引物,优化反应条件,建立了OsHV-1的原位LAMP检测方法。基于该方法对2019年以来采集的长牡蛎(Crassostrea gigas)、福建牡蛎(Crassostrea angulata)、栉孔扇贝(Chlamys farreri)、虾夷扇贝(Mizuhopecten yessoensis)、毛蚶(Scapharca subcrenata)和菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)样本进行检测。结果显示,毛蚶样本的OsHV-1原位LAMP检测结果呈阳性;其他几种贝类部分样本的实时定量PCR (qPCR)检测呈阳性,但原位LAMP检测呈阴性。对毛蚶样本的原位LAMP检测结果分析发现,病毒杂交信号主要分布在外套膜和肝胰腺等器官的结缔组织,推测感染的细胞为成纤维细胞和血淋巴细胞;在闭壳肌和斧足肌肉组织的肌细胞细胞核中也发现较多杂交信号。鳃丝内和周边偶现阳性信号,推测来自渗出的血淋巴细胞。基于原位LAMP技术的OsHV-1检测结果显示,毛蚶是OsHV-1的一种易感宿主,毛蚶结缔组织、肌肉组织和血淋巴细胞对该病毒有强亲嗜性。     

对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌双重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立与应用

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病,给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂,现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长,对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性,基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高,最低检测限分别为5.43×100和4.31×101 copies/μL,样品平均检测时间为26 min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性,以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明,感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB;从感染2 h的结果来看,pirB比pirA检出率更高。此外,致病因子pirA和pirB比toxR的检出率更高,更适合对AHPND致病原的检测。本研究建立的微流控荧光定量PCR检测的方法具有快速、灵敏、高通量、污染少、现场检测、一体化集成等优点。该技术不仅适用于实验室,更符合养殖基层的现场快速检测需求,为及早认知疾病发生风险和病害精准防控提供了新的技术手段与理论支撑。     

温度对不同家系凡纳滨对虾个体能量收支的影响

摄食代谢及能量收支是反映凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)生长状况的重要指标,也是速生经济性状的重要选育指标。本文研究了温度(20、25、30和35 ℃)对凡纳滨对虾3个家系(N310004、N310010和N310011)的生长和能量收支的影响。实验周期为40 d,每隔10 d测定一次摄食率、耗氧率、排氨率和排粪率等生理指标,并分析了不同时期[S1 (0~10 d)、S2 (11~20 d)、S3 (21~30 d)和S4 (31~40 d)]凡纳滨对虾家系的个体能量收支情况。结果显示,30 ℃时,家系N310004生长最快,总特定生长率为(9.79±0.22)%/d,S1和S4时期的特定生长率均显著高于其他2个家系(P<0.05)。温度和规格对家系的摄食和代谢有显著的影响。在实验温度范围内,各家系的摄食率和代谢率均随着温度的升高而增大。在同一温度下,除S1时期外,家系N310004的摄食率均显著高于其他2个家系。在S1和S2时期,N310011家系的耗氧率较大,在S3和S4时期,N310010家系的耗氧率显著高于N310011和N310004家系。在S1、S2和S3时期,N310004家系的排氨率显著低于其他家系;在S1、S2、S3和S4四个时期,N310010家系的排粪率显著高于其他家系。凡纳滨对虾摄入能量主要用于呼吸代谢,代谢能占比在(64.89±0.52)%~(77.81±0.78)%之间。3个家系的生长能均与温度呈倒钟形,峰值出现在30 ℃。N310004家系在20~35 ℃条件下的生长能及生长能占比均显著高于其他2个家系,主要是源于其较高的能量摄入,呼吸能和代谢能较低的缘故。     

牡蛎–海参筏式综合养殖可行性研究

为探究牡蛎–海参筏式综合养殖模式的可行性,在2个具有代表性的牡蛎养殖区——山东荣成桑沟湾和乳山挂子场海域开展了长牡蛎(Crassostrea gigas)–仿刺参(Apostichopus japonicus)筏式笼养效果对比实验。在牡蛎养殖笼中,奇数层放养长牡蛎,偶数层放养仿刺参。实验设置3个因子：偶数层的底盘类型(普通养殖盘、无孔养殖盘和无孔养殖盘加无节网)、放养仿刺参的密度(1、2和4头/盘)和放养海域(桑沟湾和挂子场),共18个处理组,每组5个重复,实验期为2020年11月—2021年6月。实验期间,对两海域水体6项指标(叶绿素a、颗粒有机物、活性磷酸盐、亚硝酸盐、硝酸盐和铵盐)和实验动物的生长、存活等方面进行跟踪测定和比较分析。结果显示,两海域叶绿素a和颗粒有机物无显著性差异(P>0.05),但其他4项营养盐指标均差异显著(P<0.05)。处理组中,两海域各处理组间牡蛎个体体重及肥满度无显著差异(P>0.05),海参低密度处理组中,海参个体体重及成活率显著高于海参高密度处理组(P<0.05);在其他处理条件相同时,无孔养殖盘处理组的仿刺参个体体重高于普通养殖盘处理组,在挂子场海域有显著差异(P<0.05)。本研究表明,在牡蛎养殖笼偶数层使用无孔养殖盘并放养1头仿刺参,能在降低牡蛎养殖密度的同时,显著提高仿刺参的个体体重和成活率。综上,该牡蛎–海参筏式综合养殖模式可以作为牡蛎规模化养殖区的有益补充     

脉红螺对不同贝类的摄食行为特征研究

过模拟自然环境,研究了脉红螺(Rapana venosa)对生境中存在的不同贝类的摄食选择性及其摄食行为过程和摄食节律。在水族箱中投放3种规格的脉红螺和3种规格的四角蛤蜊(Mactra veneriformis)、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)、紫贻贝(Mytilus edulis)和长牡蛎(Crassostrea gigas)活体饵料,记录3种规格的脉红螺对不同饵料的摄食个数、摄食重量、摄食规格、摄食时间以及摄食行为过程。结果显示,脉红螺对4种贝类均有摄食,其中,不同规格脉红螺对四角蛤蜊的摄食个数及重量显著高于其他贝类(P<0.05),摄食指数超过50%,表现为喜食,对牡蛎和菲律宾蛤仔正常摄食,只有大规格脉红螺对紫贻贝有少量摄食。在摄食规格选择方面,3种规格的脉红螺明显喜食较大规格的四角蛤蜊以及小规格的长牡蛎(P<0.05)。大规格脉红螺的摄食率为7.15%,显著小于其他2种规格的脉红螺(小规格：10.98%;中规格：9.64%)。在本实验条件下,脉红螺摄食有明显的周期性,每隔3 d进行摄食活动,摄食时间为20:00~24:00。脉红螺的摄食过程可分为未摄食阶段、搜寻阶段、摄食阶段和摄食结束4个阶段。在摄食过程中,脉红螺主动搜寻贝类,腹足将贝类从沙中移出并包裹,在包裹的同时分泌黏液并将吻从贝壳缝隙伸入,在吸食被消化液分解的贝类软体部分之后潜入沙中或附在水族箱壁。研究表明,在本实验条件下,脉红螺对饵料贝的种类和规格有明显的摄食偏好性,明显喜食四角蛤蜊,极少摄食贻贝,并且其摄食行为具有夜行性和明显的周期性,即每3 d的上半夜进行一次摄食活动。     

中华蛸消化系统组织学结构及消化酶活性研究

为探明中华蛸(Octopus sinensis)的消化机能,明确适宜的投喂频率,减少互残造成的经济损失,本研究对中华蛸消化系统各器官进行组织学观察,并比较了摄食前后各消化器官消化酶活性以及机体营养物质的代谢水平的变化。结果显示,中华蛸嗉囊、胃、盲囊和肠由黏膜层、黏膜下层和肌层组成,内壁含有较多的褶皱,胃壁肌层最发达,盲囊和肠黏膜褶皱层无护膜;前唾液腺和后唾液腺均为复合管状腺,由腺管及大量的分泌导管组成;肝脏内肝小叶界限不易分辨。中华蛸摄食后,胰蛋白酶活性显著高于脂肪酶和淀粉酶活性。肝脏是分泌消化酶的重要器官,胰蛋白酶活性在肝脏最高为(148.74±21.25) U/mg,淀粉酶和脂肪酶活性在肝脏和胃最高。摄食后血浆总蛋白在120 min达到最低值后上升,血糖和肌糖原浓度在200 min达到最大值后下降,血浆胆固醇和血浆甘油三酯浓度变化幅度较小。消化过程分为2个阶段：第1阶段食物进入嗉囊和胃部,肝脏分泌大量胰蛋白酶,机体的营养物质为消化过程供能,含量下降;第2阶段胰蛋白酶活性处于较高水平,营养物质逐步被消化吸收。中华蛸完整的消化吸收过程约400 min,研究表明,中华蛸养殖生产中适宜的投喂间隔时间为6~7 h。