小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证

【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA文库,通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2互作的蛋白,并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA为模板克隆得到TaMAPK2,构建pGBKT7-TaMAPK2诱饵载体,将诱饵载体pGBKT7-TaMAPK2质粒以及pGADT7和小麦cDNA文库共转化酵母AH109菌株感受态细胞,在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基上30℃培养3-5 d,挑选单克隆于YPDA培养基中培养,吸取1 μL各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal平板上培养,筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分析,初步获得与TaMAPK2互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建pGADT7-HSP90以及pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90双分子荧光互补表达载体,将重组载体质粒pGADT7-HSP90和pGBKT7-TaMAPK2共转化AH109酵母感受态细胞,利用酵母双杂交的方法验证TaMAPK2与候选蛋白HSP90的相互作用;采用PEG-Ca2+介导法将双分子荧光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2和pSPYCE-HSP90共转化小麦原生质体细胞,激光共聚焦显微镜下观察相互作用产生的YFP荧光信号。根据HSP90的保守序列设计特异引物,在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上,构建HSP90的实时荧光定量PCR检测体系,检测HSP90在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程,表明TaMAPK2在植物的逆境信号转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc）进一步确认HSP90与TaMAPK2的互作关系。HSP90定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中,且在植物的根茎叶中均有表达,在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR分析显示,HSP90基因受到高温、低温、高盐和ABA胁迫后表达量上调。【结论】HSP90作为分子伴侣,在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累,HSP90能通过折叠已损坏的蛋白底物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中,TaMAPK2功能的发挥可能需要HSP90蛋白的参与。     

谷子WRKY36转录因子的分子特性及功能鉴定

【目的】干旱等非生物胁迫严重影响了植物的生长和作物的产量。WRKY转录因子广泛参与了植物生长发育、形态建成和代谢调控等过程,在调控非生物胁迫响应中也扮演着十分重要的角色。分析谷子SiWRKY36的分子特性和功能,解析谷子转录因子的抗逆调控机制。【方法】通过对干旱胁迫谷子转录组测序结果分析,获得了一个WRKY转录因子SiWRKY36;利用生物信息学的方法分析谷子SiWRKY36的分子特性;根据SiWRKY36蛋白序列进行同源性搜索,得到与谷子SiWRKY36蛋白序列相似度较高的其他物种的蛋白序列;使用MEGA5对谷子SiWRKY36蛋白序列及其同源序列进行多序列比对分析并构建同源物种间系统进化树;利用MEME和SMART在线工具进行蛋白序列分析;利用GSDS和PHYRE2在线工具分别对谷子SiWRKY36基因结构和三级结构进行分析;从谷子基因组数据库Phytozome获取谷子SiWRKY36上游2 000 bp作为启动子;用PLACE数据库对SiWRKY36启动子顺式作用元件进行分析;利用实时荧光定量PCR检测SiWRKY36在不同胁迫条件下（PEG、低温、NaCl、MeJA、ABA、GA和SA、H₂O₂）的表达模式;分别以8种胁迫处理的谷子cDNA作为模板,以谷子Si001873m.g为内参,以SYBR Green染料法进行real-time PCR。用实时荧光定量PCR仪进行PCR扩增;将SiWRKY36的cDNA序列连入带有CaMV 35S启动子的pBI121表达载体中,构建表达载体pBI121-SiWRKY36,转入农杆菌,侵染野生型拟南芥得到转基因株系。用T₃转SiWRKY36拟南芥植株进行抗性鉴定。【结果】谷子SiWRKY36全长1 485 bp,基因编码区包含UTR区和3个内含子以及4个外显子,与柳枝稷亲缘性最高,属于WRKY转录因子家族的第一类。SiWRKY36编码蛋白包含2个WRKY保守域,预测的SiWRKY36蛋白三级结构包含2个α螺旋结构和3个β折叠结构。启动子元件分析表明SiWRKY36包含ABA-responsive element（ABRE）、MYB、MYC、low-temperature-responsive element（LTRE）、GT-1等多种逆境胁迫应答元件。实时荧光定量PCR结果显示SiWRKY36对多种非生物胁迫和激素均有不同程度的响应,但在H₂O₂和低温处理下基因表达量无明显变化;亚细胞定位结果表明SiWRKY36蛋白主要定位于细胞核中。抗性鉴定结果显示,在不进行任何处理的MS培养基上,野生型拟南芥和过表达株系拟南芥的长势基本一致;在2% PEG的处理条件下,3个转基因株系的根长、根的总表面积和根的总体积要大于野生型拟南芥。【结论】SiWRKY36转基因植株可能对轻度干旱有一定的抗性。     

普通小麦5DL染色体分选及染色体BIBAC文库构建技术体系优化

 【目的】优化小麦染色体流式分选及特定染色体BAC文库构建技术体系,为加速小麦基因组学研究提供技术支撑。【方法】采用双阻断法对中国春5DL端体根尖分生组织进行细胞周期同步化处理,结合机械匀浆法制备染色体悬浮液进行流式核型分析,分选染色体5DL及PCR检测,对小麦染色体分选技术体系进行优化。对复合峰分选产物Bam HI酶切制备高分子量（high molecular weight,HMW）DNA,按10﹕1质量比与双元细菌人工染色体（binary-bacterial artificial chromosome,BIBAC）连接,电激转化感受态细胞DH10B,随机挑取100个重组子,经NotI完全酶切后脉冲电泳检测插入片段大小,优化小麦染色体BAC文库构建的技术体系。【结果】经1.25 mmol•L-1 羟基脲（hydroxyurea,HU）18 h,恢复6 h和1 µmol•L-1 氟乐灵（trifluralin）2.5 h的顺序处理的小麦根尖分生组织,细胞有丝分裂指数可超过60%。流式核型分析表明,5DL端体的流式核型图由清晰的三个复合峰和两个单峰组成。PCR鉴定表明,其中一单峰确由5DL染色体组成。部分酶切复合峰染色体3～10 min,可以获得50～300 kb 的HMW DNA。连接产物检测显示平均插入片段可达100 kb左右,根据荧光通道值,估算5DL端体的大小约为482 Mb,构建库容为19 000个克隆的5DL端体特异文库即可达到约4倍的覆盖率。【结论】上述两项优化技术适用于小麦染色体的分选及染色体特异文库的构建。     

小麦ERF类转录因子W17的结合特异性及亚细胞定位分析

 【目的】构建ERF（ethylene-responsive element binding factor）转录因子基因W17的亚细胞定位载体和原核表达载体,验证W17是否具有核定位功能,阐明W17与GCC、DRE探针的体外结合特性,利用GUS瞬时表达系统分析W17蛋白的体内结合特性和转录激活功能,初步预测W17在植物胁迫信号传导途径中的作用。【方法】构建W17/163hGFP亚细胞定位载体,基因枪转化洋葱表皮细胞,暗培养24 h后共聚焦显微镜下观察。构建W17/pGEX-4T-1原核表达载体,转入大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG（0.5 mmol•L-1,3 h）诱导,GST纯化柱纯化,纯化的融合蛋白与[γ-32P]ATP标记的GCC、DRE探针混合进行凝胶阻滞试验。构建GUS瞬时表达系统,通过农杆菌介导转化烟草,X-Gluc染色、酒精脱色后体视显微镜下观察。【结果】W17基因具有核定位功能,纯化的融合蛋白GST/W17能与正常GCC、DRE探针体外特异结合,与突变GCC、DRE探针不结合,在植物体内与GCC特异结合并能激活下游GUS基因表达。【结论】W17通过自身的NLS进入核内行使功能,参与了GCC-box调控的生物胁迫信号传导途径,还可能参与了非生物胁迫（盐胁迫）传导途径。     

兼抗条锈、白粉病小麦新种质观4的分子标记鉴定

将多个不同的抗病亲本及优良农艺亲本进行复合杂交,选育出抗病且农艺性状较好的小麦新品系观4.为了明确观4的抗病性及品质状况,对该品系的抗病基因及品质性状进行分子标记鉴定和分析.结果表明,观4兼抗白粉病和条锈病,其白粉病抗性主要来自亲本92R179中的Pm21基因,而条锈病抗性则主要源于YW243中的抗条锈病基因YrX;辽春10号中的高分子量麦谷蛋白优质亚基7+8也遗传到新品系观4中.因此,观4可作为优良小麦亲本应用于小麦品质和白粉病、条锈病抗性的改良.     

甘蓝型油菜SERK基因家族的鉴定与系统进化分析

体细胞胚胎发生类受体激酶（somatic embryogenesis receptor-like kinase，SERK）与植物体细胞胚发生，尤其是与植物非生物逆境胁迫响应有关。为鉴定甘蓝型油菜中BnaSERK基因家族成员、揭示其进化关系及其与油菜盐/旱胁迫的响应，利用生物信息学方法对甘蓝型油菜品种中双11的SERK家族成员、基因结构、进化关系、选择压力等进行系统分析，并初步分析了部分BnaSERK基因在盐/旱胁迫下的表达响应模式。结果表明：在甘蓝型油菜基因组共鉴定到24个BnaSERK基因，它们不均等地分布在15条染色体上，可分为3个亚族，具有相对保守的基因结构和保守基序，且含多种与激素和非生物胁迫响应相关的顺式作用元件。共线性分析表明，甘蓝型油菜和拟南芥、白菜、甘蓝分别有14对、44对和32对基因表现出共线性。基于比较基因组学研究，甘蓝型油菜BnaSERK基因在经历多倍体化之后，出现了不同程度的丢失现象。分析表明，BnaSERK基因家族在芸薹属物种间的进化相对保守。盐/旱胁迫下的5个BnaSERK基因在叶片中的表达模式分析结果显示，BnaA07g29610D、BnaC01g43240D、BnaCnng07810D基因在盐胁迫下表达量上调，而BnaA01g23070D、BnaA07g23390D基因则表现为下调；BnaA07g23390D、BnaA07g29610D基因在干旱胁迫下表现为上调表达，而BnaC01g43240D、BnaCnng07810D、BnaA01g23070D基因呈下调趋势。表明BnaSERK基因可能在油菜响应盐/旱胁迫的调控机制中发挥着重要作用。     

W16转济麦19小麦株系抽穗期抗旱性研究

以两个转W16基因小麦株系及相应的受体对照品种为材料,在大田控水的条件下研究了水分胁迫对转基因小麦抽穗期相关生理特性的影响,利用方差分析方法对转基因株系的抗旱性进行了综合评价.结果表明:转基因株系和对照及受体有着较大的差异,随着水分胁迫的加剧,参试品种的相对含水量、气孔导度、光合速率、叶绿素含量呈下降趋势,转基因小麦的下降幅度较小;丙二醛含量、胞间CO2浓度、质膜相对透性呈上升趋势.受体对照品种的上升幅度大于转基因小麦;转基因小麦的脯氨酸含量显著高于对照品种.方差分析表明,转基因小麦株系G19-X51、G19-X61具有较好的抗旱性.     

拟南芥H~+_-焦磷酸化酶AVP1互作小GTP结合蛋白AtRAB的特性鉴定与功能分析

以拟南芥AVP1为诱饵,采用膜蛋白酵母双杂交系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与AVP1互作的小GTP结合蛋白AtRAB。酵母互作试验表明,AVP1和AtRAB存在互作;双分子荧光互补实验(BiFC)证明,AVP1和AtRAB能在质膜和细胞核上发生相互作用。野生型拟南芥(WT)、AtRAB和AVP1的拟南芥突变体rab和avp1在高盐胁迫条件下,随着NaCl浓度的加大,突变体rab和avp1的表型变化相似,相对于WT都表现为根长缩短,侧根数减少;在低磷处理条件下,随着磷浓度的逐渐降低,2个突变体的表型相似,相对于WT同样表现为根长缩短,总根面积减少,侧根数减少;在相同磷浓度条件下,突变体rab对胁迫的反应比avp1强;在低钾处理条件下,随着钾浓度的降低,2个突变体的表型与在低磷胁迫处理条件下的表型相似。结果说明,AVP1和AtRAB可以在细胞膜和细胞核上相互作用,AtRAB能够影响植物对离子的吸收,AVP1和AtRAB的突变体在高盐、低磷和低钾等胁迫条件下表型变化相似,证明了2个基因都正向调控植物对高盐、低磷和低钾胁迫的反应,它们属于同一信号途径。     

以流式核型分析小麦根尖细胞的有丝分裂同步化过程

构建染色体特异文库是简化小麦基因组测序的有效途径,而通过同步化处理提高根尖细胞有丝分裂指数,使根尖细胞中富集高比例的中期染色体是实现染色体分选成功的前提。采用双阻断法用50 µmol L^-1羟基脲和100 µmol L^-1氟乐灵对普通小麦根尖细胞进行同步化处理,然后用流式核型分析法观测各周期细胞在不同时间点上的比例变化。结果显示,最佳方案为羟基脲处理10 h,恢复7 h,氟乐灵处理4 h。以此方案处理中国春小麦根尖可获得最高的有丝分裂指数,达70.1%。附加冰水处理(0°C)有助于减少染色体碎片和增加流式核型的分辨率,但对富集更多的中期染色体没有效果。