披碱草(Elymus dahuricus)焦磷酸化酶基因EdHP1的克隆及功能鉴定

为了从抗逆性优良的牧草中挖掘新的耐盐、抗旱基因,进而为作物分子育种提供优良的基因资源,采用RACE(Rapid-Amplification of cDNA Ends)方法,克隆了披碱草的焦磷酸化酶基因EdHP1,其全长序列包含2310bp,编码770个氨基酸,含有14个跨膜区,是一个典型的膜蛋白,同时包舍三个保守区(CS1、CS2和CS3).氨基酸同源性比较发现,EdHP1与来自大麦等10种高等植物的焦磷酸化酶基因的同源性大于86%.EdHP1基因的表达受干旱、高盐和低温等非生物胁迫的诱导.功能分析证明,EdHP1基因能够显著提高转基因烟草对干旱、高盐胁迫的抗性,可用于作物的抗逆遗传改良.     

谷子F-box家族基因的鉴定、分类及干旱响应

蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动对维持植物正常生长发育和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性本研究根据谷子转录组分析结果从个家族成员中鉴定出个在干旱胁迫下表达量上调的基因根据序列相似性将其分为类同一类基因具有相似的内含子外显子结构染色体定位分析发现这些基因分别分布在谷子的条染色体上其中第条染色体上含基因最多有个。结构域分析结果表明个蛋白均含保守的结构域而端含、、、、和等结构域。启动子元件分析表明谷子个基因均含逆境应答元件其中和元件的数量最多个说明这些基因对干旱应答反应可能主要受、转录因子调控。转录组分析结果表明基因对干旱胁迫的响应远远高于其他成员对干旱、高盐、、和都有响应亚细胞定位结果显示蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解基因的功能提供了依据。F-box蛋白参与细胞周期调控、细胞凋亡及信号转导等多种生命活动, 对维持植物正常生长发育a和介导非生阿物胁迫响应等过程发挥重要作用。谷子具有显著的耐旱耐瘠薄等特性, 本研究根据谷子转录组分析结果, 从525个F-box家族成员中鉴定出19个在干旱胁迫下表达量上调的F-box基因; 根据序列相似性将其分为6类, 同一类基因具有相似的内含子-外显子结构; 染色体定位分析发现, 这些基因分别分布在谷子的8条染色体上, 其中, 第2条染色体上含F-box基因最多, 有6个。结构域分析结果表明, 19个F-box蛋白均含保守的F-box结构域, 而C端含FBD、WD40、FBA、ZnF、Kelch和LRR等结构域。启动子元件分析表明, 谷子19个F-box基因均含逆境应答元件, 其中, MYB和MYC元件的数量最多(9~78个), 说明这些基因对干旱应答反应可能主要受MYB、MYC转录因子调控。转录组分析结果表明, SiF-box18基因对干旱胁迫的响应远远高于其他F-box成员, 对干旱、高盐、ABA、SA和JA都有响应; 亚细胞定位结果显示, SiF-box18蛋白定位在细胞核中。本研究为进一步深入了解SiF-box18基因的功能提供了依据。     

转EdHP1(氢离子焦磷酸化酶)基因烟草促进钾离子吸收的生理机制

钾是植物生长必须的重要矿质元素,提高作物对钾的吸收是提高作物产量的重要途径。本研究以前期遗传转化披碱草EdHP1(H+-pyrophosphatase)基因的烟草为材料,在低钾处理条件下比较了转基因烟草和野生型烟草的生理特性。结果显示,在低钾条件下,野生型烟草体内K+积累量只相当于转基因烟草的62.9%。野生型烟草的总根长、总根表面积、总根体积明显低于转基因烟草(P0.05),分别为转基因烟草的72.9%、68.1%和60.6%。在不同直径根系(0.5～2.0、2.5～4.5、4.5mm分别为细根、中等根和粗根)中,细根发育差异最大,野生型烟草为转基因烟草的72.9%。低钾条件下,转基因烟草根系活力是野生型烟草的1.2倍,野生型烟草根系焦磷酸化酶活力相当于转基因烟草的46.4%,根部游离IAA含量相当于转基因烟草的66.2%。通过非损伤方法测定根部K+和H+流速结果显示,在根系表面积相似情况下,低钾条件下野生型烟草外排钾速率显著高于转基因烟草,而氢离子外排速率显著低于转基因烟草。综上所述,发达的根系和较高的K+转运体活性综合作用显著提高了转基因烟草根部对K+的吸收。     

以小麦根尖分生组织细胞核及染色体制备高分子量DNA

为了克服以叶片为材提取HMW DNA的局限性,优化了一套简便、实用的提取方法。该法以细胞周期同步化处理的根尖分生组织为材,利用机械匀浆释放细胞核或中期染色体制备悬浮液,再以蔗糖密度梯度离心和流式分选技术分别分离细胞核和染色体,经去蛋白、酶切,透析获得HMW DNA。经检测,来自200条根尖（10个胶块）的HMW DNA的浓度约为4~20 ng/µL,而连接、转化后的BAC克隆平均插入片段超过100 kb。证明该法适用于提取HMW DNA以构建BAC文库。     

谷子PP2C基因家族的特性

PP2Cs (2C type protein phosphatases)是一种单体丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶,在真核生物中,PP2Cs在脱落酸(ABA)、茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)等激素信号传导途径中起着重要的调控作用。本研究通过序列比对,从谷子基因组中筛选出80个PP2C候选基因,聚类分析将其分为12个亚族(A、B、C、D、E1、E2、F1、F2、G、H、I、J)。与拟南芥PP2C基因家族比对表明,A~I为2个物种共有的亚族,J亚族只存在于谷子基因组中,L亚族只存在于拟南芥中。将谷子A亚族的10个成员命名为SiPP2CA1-10。基因表达谱分析表明,A亚族基因不同程度受ABA、干旱、高盐、低温和低氮诱导表达,其中,SiPP2CA6、SiPP2CA8在5种处理下诱导表达量都高。对10个A亚族成员的启动子分析发现,在这些基因的启动子序列中含有多种参与逆境胁迫应答的顺式作用元件,其中,SiPP2CA5、SiPP2CA6、SiPP2CA7、SiPP2CA8的启动子中含有参与低氮胁迫响应的元件。进一步研究发现,SiPP2CA8主要在根部表达,且在低氮胁迫下一直有较高的表达水平。亚细胞定位结果显示SiPP2CA8定位在细胞膜、细胞质、细胞核中;双分子荧光互补试验(BiFC)结果表明,SiPP2CA8与一个ABA受体类似蛋白SiRCAR3(基因号Si018317m.g)在细胞膜、细胞质及细胞核上互作,表明SiPP2CA8在谷子中可能参与ABA信号传导过程。     

拟南芥G蛋白α亚基GPA1互作蛋白铜离子结合蛋白AtBCB的鉴定及功能分析

拟南芥G蛋白复合体(异源三聚体包括α、β、γ亚基)参与植物多个信号转导途径,G蛋白复合体通过膜上的G蛋白偶联受体(GPCR)接受胞外信号后通过3个亚基将信号传递给下游效应器。目前,有关植物G蛋白复合体的效应器及其信号传递途径的报道较少,寻找新的G蛋白的效应器有助于阐明G蛋白复合体相关的信号传导途径。本研究以拟南芥G蛋白α亚基GPA1为诱饵蛋白,利用泛素分离系统筛选拟南芥cDNA文库,获得一个与GPA1互作的铜离子结合蛋白AtBCB。荧光双分子杂交(BiFC)试验证明,GPA1与AtBCB的互作发生在细胞膜上。基因表达特性分析结果显示,GPA1和AtBCB受金属铝胁迫的诱导表达。进一步以野生型拟南芥(WT)、GPA1拟南芥突变体gpa1-4和AtBCB拟南芥突变体bcb为材料,研究该基因对植物耐金属铝胁迫的功能,结果显示,在无胁迫情况下,2个突变体和WT根部的丙二醛含量无显著差异;在100 µmol L^–1 Al³⁺处理下,gpa1-4突变体根部丙二醛含量显著(P<0.05)低于WT低;bcb根部丙二醛含量极显著(P<0.01)高于WT。对3个铝胁迫响应基因(苹果酸转运体基因AtALMT1、半类型ABC转运蛋白基因ALS1和ABC转运蛋白基因ALS3)的表达进行Real-time PCR分析,比较它们在突变体和野生型之间的表达差异,发现在有铝和无铝处理情况下,ALS1和ALS3的表达水平在突变体和WT间均无显著差异;在铝处理下,gpa1-4中AtALMT1的表达量极显著高于WT;在bcb中的表达量显著低于WT。以上结果表明,植物通过细胞膜上的G蛋白α亚基GPA1和铜离子结合蛋白AtBCB的相互作用调控下游基因AtALMT1的表达,参与植物对铝胁迫的响应,其中GPA1对铝胁迫耐受起负向作用,AtBCB对铝胁迫耐受起正向作用。     

豌豆终止子rbc-T在转基因小麦研究中的应用

目前常用的转基因载体元件大多为真菌或细菌来源,引发对转基因食品安全性的担忧。本研究克隆了豌豆终止子rbc-T,并用其替换农杆菌终止子nos-T构建转化载体,利用基因枪法将携带Ubi启动子、GUS基因和终止子rbc-T组成的最小表达框片段转化普通小麦,同时以带有nos-T终止子的载体为对照,经过PCR检测筛选获得T2代稳定遗传的转基因小麦株系。GUS组织化学染色及酶活定量分析结果表明,带有nos-T及rbc-T的转基因小麦中均能检测到GUS基因不同程度的表达。因此认为,豌豆终止子rbc-T可以代替农杆菌终止子nos-T用于小麦的转基因研究。     

一种新的快速鉴定蛋白与靶DNA结合位点的方法

DREB转录因子在植物逆境胁迫响应中起非常重要的作用, 对植物的生长发育起重要的调控作用。传统的DNA酶I足迹法应用同位素标记DNA, 采用序列胶分离DNase I酶切片段, 操作较复杂, 分辨率较低, 不适用于高通量的样品检测。为阐明植物体内DREB转录因子的调控机制, 本研究利用改进的DNA酶I足迹法(DNase I Foot-printing)结合凝胶阻滞法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA), 选用荧光色素代替同位素标记, 毛细管电泳技术代替序列胶检测DNase I酶切片段, 判定GmMYB1蛋白与GmDREB3启动子DNA结合的区域。采用限制性内切酶酶切GmDREB3启动子DNA验证以上结果。同时, 在判定的GmMYB1结合区域的基础上, 选择可能的DNA结合元件与GmMYB1进行EMSA试验, 证明GmMYB1可以与相应元件结合。该方法比传统的DNA酶I足迹法快速、简便、准确并可靠, 作为一种高通量的鉴定方法可用于大规模鉴定蛋白质的DNA结合位点。     

大豆DRT100全基因组鉴定及GmDRT100-6响应干旱和盐胁迫的功能分析

DNA损伤修复/耐受性100 (DNA-damage repair/tolerance 100, DRT100)编码一种富含亮氨酸重复序列的蛋白质,广泛参与植物生长发育与非生物胁迫响应过程。为鉴定大豆(Glycine max L.)中DRT100基因家族成员、揭示其进化关系及其与大豆抗旱耐盐相关功能,本研究在大豆全基因组水平上鉴定出8个DRT100基因,对其基因结构特征、系统进化、启动子顺式作用元件、基因表达模式等进行了分析。结果表明：8个GmDRT100基因位于5条大豆染色体上,具有相对保守的基因结构和保守基序,同时还具有多种与激素和非生物胁迫相关的顺式作用元件。RT-qPCR分析揭示8个GmDRT100家族成员在盐旱胁迫下均不同程度的上调表达,且GmDRT100-6在干旱和盐胁迫下均显著上调。进一步研究GmDRT100-6的功能,结果表明GmDRT100-6蛋白位于细胞膜中,大豆毛状根中GmDRT100-6基因的过表达提高了植株的耐旱性和耐盐性。这些研究结果表明GmDRT100-6在大豆抗旱、抗盐胁迫中发挥了重要作用。     

病毒复制酶基因Nib8和ERF转录因子W17基因枪法共转化小麦

将对小麦黄花叶病毒表现高抗的复制酶基因Nib8和具有广谱抗病性的ERF基因W17分别构建到单子叶高效组成型表达载体上,采用基因枪共转化法转化到小麦品种扬麦12和扬麦16中,PCR检测共获得Nib8基因的阳性转基因植株42株,W17基因的阳性转基因植株48株,及两个功能基因均为阳性的转基因植株6株。以扬麦12为受体的转化率分别为1.53%(Nib8)、4.87%(W17)和0.42%(Nib8+W17);以扬麦16为受体的转化率分别为2.05%(Nib8)、0.86%(W17)和0.20%(Nib8+W17)。对两个功能基因都呈阳性的6个植株进行Southern blotting分析,进一步证实功能基因已经整合到小麦基因组中。本研究为获得具有综合抗病性的小麦新材料奠定了基础。