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【目的】已有研究表明捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)Hc-hrg-2属于血红素应答基因,高浓度血红素的刺激可导致该基因的转录水平上调,但其在血红素调控中的功能尚缺乏研究。研究通过同源重组技术构建血红素合成缺陷型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)hem1敲除株,通过异源表达Hc-hrg-2对该敲除株进行表型拯救试验,以期验证Hc-hrg-2参与细胞内血红素转运的功能。 【方法】以S. cerevisiae BY4741基因组为模板,设计引物,扩增获得hem1(SGD:S000002640)基因序列5' 和3' 侧翼区同源臂;同时以pYES2-CT质粒为模板设计引物,扩增获得筛选标记URA3序列;利用两次重叠PCR技术依次将测序正确的上游同源臂、URA3、下游同源臂序列串联成基因敲除组件,并通过醇沉法对敲除组件进行纯化。采用醋酸锂转化法将纯化的敲除组件转化至BY4741感受态细胞中, 经SD/- URA(含250 μmol·L-1 5-氨基乙酰丙酸(ALA))培养基筛选,并利用多对引物进行PCR鉴定,以验证Δhem1敲除株的正确性。同时以含有H. contortus 浙江株Hc-hrg-2 序列(GenBank:MK371241)及其功能域缺失序列Hc-hrg-2(Δgst-n) 和Hc-hrg-2(Δgst-c) 的质粒为模板,利用特异性引物分别进行PCR扩增,通过无缝克隆将扩增得到的目的片段插入酵母pESC-LEU表达载体,经PCR鉴定以及测序验证后,采用醋酸锂转化法将正确的表达载体转化至Δhem1感受态细胞中,通过SD/- URA/- LEU(含250 μmol·L-1 ALA)培养基筛选以及PCR鉴定验证阳性异源表达株的正确性。通过比较Δhem1敲除株及其各异源表达株在含有或不含有250 μmol·L-1 ALA的SD/- URA/- LEU液体培养基中的生长情况,进一步验证敲除株的表型同时排除表达载体对表型的影响。用2%半乳糖对含有阳性表达质粒的敲除株进行诱导,取部分菌液进行超裂破碎,收集蛋白,通过Western Blot鉴定目的蛋白的表达;剩余菌体用去离子水重悬至OD600 = 0.2,用去离子水进行5倍比稀释,取4 μL稀释后的菌液点至含有250 μmol·L-1 ALA或者不同浓度血红素的诱导平板上,28℃培养2—3 d后比较敲除株的生长情况。【结果】成功获得hem1基因敲除株Δhem1,与野生株相比,Δhem1不能合成血红素,需外源添加ALA(250 μmol·L-1)或血红素(≥ 10 μmol·L-1)才能生长,且异源表达株和敲除株的表型一致。Western Blot结果表明2%半乳糖能诱导Hc-hrg-2及其功能域缺失基因在敲除株中成功表达,且表达Hc-hrg-2能够在低血红素浓度下(≤ 1 μmol·L-1)促进酵母对血红素的摄取,拯救敲除株的生长缺陷,其硫氧还蛋白样结构域(GST-N)和谷胱甘肽S-转移酶C末端结构域(GST-C)的缺失会降低拯救的效果。【结论】捻转血矛线虫血红素应答基因Hc-hrg-2可促进细胞对血红素的摄取,其GST-N和GST-C功能域在该过程中发挥着重要作用,研究成果为后续深入研究捻转血矛线虫的血红素转运机制奠定基础。 相似文献
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电网设置分布区域较为广泛,受自然因素影响较大,线路较长,容易受到雷电冲击引起电网跳闸等事故,严重影响电网运行的安全性与可靠性。我国平煤神马集团矿区电网雷电事故频发,雷电击隐秘,线路抢修困难,因电网事故导致矿井电气设备无法正常运行,影响煤矿安全作业。提出雷电区域性预防和定位技术相结合,构建区域性预防系统,实现矿区雷电活动有效监测,为矿区安全生产提供技术支持。 相似文献
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[目的]探索一种有效的黄秋葵保鲜方法。[方法]以黄秋葵为试材,分别经冷水预冷处理和冷水预冷复合纳他霉素处理后,放置在4℃条件下贮藏16 d,研究其贮藏期间品质的变化。[结果]与单独冷水预冷处理相比,冷水预冷复合纳他霉素处理可以更有效地抑制黄秋葵在低温贮藏期间叶绿素的降解,延缓果实可溶性糖、可溶性蛋白和维生素C含量的下降,维持果实较高的总酚含量和抗氧化能力,提高了果实的商品率,延长了果实的货架期。[结论]冷水预冷复合纳他霉素处理可以作为一种有效的保鲜方法在采后黄秋葵果实的实际贮运中应用。 相似文献
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对比分析兵团和地方两种土地经营管理模式下两种典型土地利用变化的差异,对认识不同人类活动方式对土地利用的影响有重大意义。以新疆玛纳斯河流域兵团、地方为研究对象,利用1972—2015年Landsat MSS/TM/OLI以及CBERS-02B遥感影像数据,综合分析两种典型土地利用变化。结果表明:(1)兵团、地方土地利用变化差异主要体现在耕地、建设用地上,兵团耕地变化更为显著,地方建设用地变化更为显著。(2)不同于地方小规模自主经营模式,地块规模有限,破碎度较高;兵团实行大规模统一管理的土地利用模式,土地整合频率较高,地块不断集中,景观格局趋于简单。(3)兵团与地方土地利用变化程度及景观格局存在显著差异的主要原因在于土地经营管理模式的不同。 相似文献
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以颠茄(Atropa belladonna)幼苗为材料,研究了不同质量浓度(0,100,200,300和400μmol/L)茉莉酸甲酯(Methyl Jasmonate,MeJA)处理不同时间(7,14,21和28d)对颠茄鲜质量、光合色素和主要含氮化合物质量分数以及氮代谢关键酶活性的影响,为药材产量的提高提供理论依据.结果表明,随处理时间的延长,各质量浓度MeJA处理组中颠茄鲜质量、光合色素质量分数呈降低的趋势,并明显低于同时期对照(0μmol/L);相反可溶性蛋白(SP)、游离脯氨酸(Pro)质量分数呈增加的趋势,其中低质量浓度(100,200μmol/L)MeJA更能促进SP,Pro质量分数的积累.在MeJA处理28d时,硝态氮质量分数显著降低(p0.05);硝酸还原酶(GS)与谷氨酰胺合成酶(NR)活性的变化趋于一致,呈先升高后降低趋势,均是在200μmol/L MeJA处理时活性达到最高值,分别是对照的1.35倍和1.672倍.综上,MeJA能够抑制颠茄的生长,降低光合色素、硝态氮质量分数,而低质量浓度MeJA可提高SP,Pro质量分数以及GS,NR活性,因此在颠茄人工栽培过程中喷施低质量浓度MeJA有利于颠茄的生长和氮素代谢. 相似文献
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