三种CRISPR/Cas9基因敲除变异检测方法的比较分析

比较三种常用的CRISPR/Cas9基因敲除检测变异方法,从准确性、耗时、成本和应用限制等方面进行评估。采用T7核酸内切酶I、限制性内切酶和非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法分别对利用CRISPR/Cas9方法敲除的fibinb和ngs基因的50尾斑马鱼(Danio rerio)突变纯合个体和突变杂合个体进行检测,用野生型个体作对照;同时用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对CRISPR/Cas9方法敲除的ogn和ddb1基因的突变杂合个体进行了检测。结果表明:三种方法均能够区分突变杂合个体,其中T7核酸内切酶I检测法耗时最短,但该方法不能用于鉴定突变纯合个体;限制性内切酶检测法能够用于鉴定纯合个体,但需要有特异性的识别位点;非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法能够区分纯合和杂合个体,对序列无依赖性,能够检测出序列中存在的所有变异。成本上,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳法最经济;限制性内切酶的价格存在较大的差异,因此检测成本依赖于酶的价格。三种检测方法各有优缺点,在应用实践中可根据试验需要选择合适的方法。     

两个马氏珠母贝养殖群体遗传多样性微卫星分析

以两个马氏珠母贝(Pinctada martensii Dunker)养殖群体为对象,采用微卫星分子标记技术对两个群体的遗传结构进行了研究,分析了各群体内的遗传多样性和两个群体间的遗传分化.结果表明,在广东养殖贝和三亚养殖贝群体中,分别获得232和230条扩增片段,两群体的平均观测杂合度分别为0.28和0.29,平均多态信息含量分别为0.44和0.46,平均有效等位基因数分别为2.25和2.13,显示两个群体的群体遗传多样性水平相差较小(p<0.05),两群体间遗传变异性小,其遗传多样性处于中等水平.两个养殖群体的基因分化系数(GST)为0.0448,群体之间属于轻度偏中度分化水平.     

哲罗鱼种质资源研究现状

哲罗鱼Hucho taimen(Pallas)又称哲罗鲑,鲑形目,鲑科,哲罗鱼属.是鲑科鱼类中个体最大也最易濒临灭绝的种类[1],也是我国名贵冷水鱼类,名列黑龙江"三花五罗"之首,其肉质细嫩,味道鲜美,重达数十斤,属大型冷水性经济鱼类,是人们餐桌上的佳品,有极高的经济价值[2].     

哲罗鱼基因组微卫星富集文库的构建与分析

采用磁珠富集法构建哲罗鱼（Hucho taimen Pallas）荩因组微卫星文库。哲罗鱼基因组DNA经MboⅠ限制性内切酶消化后，选取400-900bp的片段，用生物素标记的简单重复序列（ACA）15作探针与其杂交，杂交复合物结合到包被有链霉亲和素的磁珠上，获得目的片段，连接T载体克隆，构建基因组微卫旱富集文库。再用同位素标记的（ACA）15探针进行二次筛选，筛选出686个阳性克隆，阳性克隆率为35．94％。对其中140个阳性克隆进行测序，共获得149个微卫星序列，4个小卫星序列，其GenBank Accession Number为DQ110955～DQ121108。其中perfect（完美型）62个，占41．61％；imperfect（非完美型）92个，占61．74％；compound（混合型）5个，占3．36％，重复次数主要分布于6～45（81．21％），平均重复次数为32．5，这表明（ACA／TGT）。在哲罗鱼基因组DNA中含最非常丰富。本研究旨为从DNA水平上研究哲岁鱼种群结构、遗传多样性及目前群体现状等方面提供有效工具。     

哲罗鱼人工繁殖技术要点

采捕乌苏里江野生哲罗鱼，在池塘养殖条件下，人工培育至性成熟，使用人工合成催产药物进行繁殖试验。结果表明：人工繁殖是行之有效的。同时，对操作过程中遇到的技术要点进行概括和总结，为哲罗鱼苗种的批量生产奠定了基础。     

玻璃缺鳍鲶线粒体全基因组序列测定与分析

本文采用参照近缘物种线粒体基因组设计覆盖全基因组引物的方法构建并获得玻璃缺鳍鲶Kryptopterus vitreolus线粒体基因组全序列,分析其全序列特征和结构,为鲇形目鱼类的系统进化研究提供基础数据。结果表明,玻璃缺鳍鲶线粒体基因组全长16 662bp,碱基组成具有高AT含量的偏向性,结构组成和排列顺序和其他硬骨鱼基本一致,包括13个蛋白质编码基因、22个t RNA、2个r RNA和1个D-loop区。全基因组中除COX1以GTG为起始密码子外,其余12个编码蛋白的基因都以ATG开头。7个编码蛋白基因(ND1、Cox1、ATP8、ATP6、ND4L、ND5和ND6)以TAA终止,其余6个编码蛋白的基因没有完整的终止密码子。对玻璃缺鳍鲶线粒体基因组D-loop区的终止序列区、中央保守区和保守序列区的结构分析,识别5个保守序列(CSB-1、CSB-2、CSB-3、CSB-D和CSB-E)和一个潜在的终止序列E-TAS。利用玻璃缺鳍鲶分别与其他4种鱼的线粒体基因组全序列及13个编码蛋白基因的核苷酸序列进行比对分析。结果表明,玻璃缺鳍鲶与南方鲇Silurus meridionalis同源性最高,5种鱼线粒体基因组中COX1基因相对最保守,相似度为78.98%~92.78%。基于5个科12种鱼与2个外群物种的线粒体控制区(D-loop区)的核酸序列构建的系统进化树表明:玻璃缺鳍鲶独自一支且与鲇Silurus asotus和南方鲇亲缘关系最近。     

鲇仔鱼的摄食和生长研究

对鲇Parasilurus asottts L仔鱼摄食和生长试验的结果表明,在自然水温(18～2l℃)条件下,鲇仔鱼6日龄开口摄食,初次摄食率为22％;8日龄卵黄囊消失,此时饥饿仔鱼的摄食率最大(74％);混合营养期为6～8日龄,耐饥饿临界点(PNR期)发生在9～10日龄。鲇仔鱼14日龄时已开始吞吐人工饲料,但不能较好地摄食;到19日龄时,能较好地摄食生长。在22～28℃下,鲇仔鱼的生长率随着温度的升高而增大,但差异不显著,表明该温度范围适合仔鱼生长。     

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）AFLP体系建立的研究

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）是一种优良的冷水性养殖鱼类,为了进行山女鳟养殖群体的遗传管理,本研究构建了山女鳟的AFLP分析体系,试验采用两组酶切组合酶切山女鳟基因组DNA,并对酶量及酶切时间、预扩增模板用量、预扩产物稀释倍数进行了优化。结果表明,100ng DNA用3U的EcoRI在37℃酶切3h后,再分别用3U的TaqI和Tru9I在65℃酶切4h连接效果最佳,取3μL连接产物进行预扩增,将预扩增产物稀释50倍进行选择性扩增,可以得到清晰的扩增图谱;对两组酶切组合进行对比发现,EcoRI-Tru9I组合扩增的条带数多于EcoRI-TaqI组合,但后者的多态性位点比例高于前者。     

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）AFLP体系建立的研究

山女鳟（Oncorhynchus masou masou）是一种优良的冷水性养殖鱼类,为了进行山女鳟养殖群体的遗传管理,本研究构建了山女鳟的AFLP分析体系,试验采用两组酶切组合酶切山女鳟基因组DNA,并对酶量及酶切时间、预扩增模板用量、预扩产物稀释倍数进行了优化。结果表明,100ng DNA用3U的EcoRI在37℃酶切3h后,再分别用3U的TaqI和Tru9I在65℃酶切4h连接效果最佳,取3μL连接产物进行预扩增,将预扩增产物稀释50倍进行选择性扩增,可以得到清晰的扩增图谱;对两组酶切组合进行对比发现,EcoRI-Tru9I组合扩增的条带数多于EcoRI-TaqI组合,但后者的多态性位点比例高于前者。