银杏HDR基因的克隆与功能分析

[目的]获得银杏HDR基因的克隆并研究HDR基因的功能.[方法]采用RT-PCR技术获得银杏HDR的全长cDNA,命名为GbHDR(GenBank登录号:DQ364231),该基因cDNA全长为1 827 bp,包含1 425 bp的开放阅读框,编码474个氨基酸残基的蛋白;并构建GbHDR的原核表达载体pTrcGbHDR,与原核表达载体pAC-BETA共转入大肠杆菌XL1-Blue,获得β-胡萝卜素工程菌.[结果]克隆基因实际长度为1 441 bp的GbHDR基因,该序列包含1 425 bp的HDR基因ORF,编码474个氨基酸残基的蛋白,其预测分子量为53.2 kD,等电点预测为5.76.功能互补分析表明,GbHDR能推动工程菌XL1-Blue+pTrcGbHDR+pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbHDR具有典型的HDR基因功能.[结论]获得1株可高量积累β-胡萝卜素的大肠杆菌工程菌,为最终实现β-胡萝卜素代谢工程提供侯选基因和作用靶点.     

颠茄高频再生体系的建立及卡那霉素抗性筛选（摘要）

[目的]建立颠茄高频再生体系及筛选卡那霉素（Kan）抗性。[方法]以颠茄叶片及腋芽为外植体,研究了培养基中6-BA和NAA不同配比对其不定芽分化的影响以及叶片不定芽对Kan的敏感性。[结果]MS＋4.5mg/L6-BA＋0.2mg/LNAA为叶片不定芽分化的最佳培养基,不定芽分化率达100%,在1.0cm×1.0cm叶块上的不定芽分化数平均达5.85;MS＋3.0mg/L6-BA＋0.1mg/LNAA为腋芽不定芽分化的最适培养基,不定芽分化率达100%,每个腋芽不定芽分化平均数为4～8个;400.0mg/LKan为颠茄叶片遗传转化的最佳筛选浓度。[结论]为颠茄无菌苗的快速繁殖以及基于叶盘法的遗传转化奠定了基础。     

铃铛子发根诱导体系及培养条件的优化

铃铛子(Anisodus luridus)是西藏特有的托品烷生物碱药源植物.利用农杆菌C58C1(pRiA4)侵染铃铛子不同器官考察发根诱导频率,并考察了7种培养基(1/2MS,MS,1/2B5,White,WPM,B5和N6)对发根生物量和托品烷生物碱质量分数的影响.真叶和茎段的发根诱导频率分别为53.33%和60.00%,子叶不能诱导出发根.PCR表明rolB和rolC基因已整合到发根的基因组中.B5培养基最适于铃铛子发根生物量和托品烷生物碱积累,发根鲜质量和干质量分别达到6.9±0.94g/瓶和0.44±0.06g/瓶;发根中莨菪碱质量分数为3.49±0.13mg/g.B5和1/2B5培养基中发根的东莨菪碱质量分数高于其他的培养基,分别为1.37±0.06mg/g和1.43±0.22mg/g,二者之间差异无统计学意义.在B5培养基中发根总生物碱产量也是最高的,为2.1±0.29mg/瓶.研究结果为利用发根规模化生产莨菪碱和东莨菪碱奠定了基础.     

青蒿CYP71AV1和CPR基因的克隆及其双元植物高效表达载体的构建

采用RT-PCR方法从青蒿中克隆紫槐二烯氧化酶基因和细胞色素P450还原酶基因编码区序列,正向插入经改造后获得的双元三价植物高效表达载体p1304*中,构建植物表达载体p1304*-CPR-CYP71AV1,并将该表达载体导入根癌农杆菌LBA4404,获得可直接用于遗传改良青蒿的工程菌p1304*-CPR-CYP71AV1-LBA4404,为利用植物基因工程技术提高青蒿素产量奠定了基础.     

番茄dxs基因的克隆及在大肠杆菌中的颜色互补

用RT-PCR (反转录- 聚合酶链式反应) 的方法从番茄中克隆到5-磷酸脱氧木酮糖合成酶(Deoxyoxylulose-5-phosphate synthase, DXS) 基因编码区(记为ledxs) , 并构建了ledxs原核表达载体pTrcLeDXS。将携带番茄红素生物合成途径上香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, crtE) , 八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase, crtB) , 八氢番茄红素脱饱和酶( phytoene desaturase, crt I) 3个关键酶基因的原核表达载体pAC-LYC转入大肠杆菌XL1-Blue。将pTrcLeDXS转入该重组工程菌, 获得番茄红素工程菌。将该菌用于构建颜色互补平板, 并进行发酵培养以检测番茄红素表达量。颜色互补平板上的菌斑呈现鲜艳的红色。经过21 h的培养番茄红素的产量达605.25μg·L^-1。结果显示:ledxs能明显推动类胡萝卜素途径向番茄红素合成的方向流动。     

银杏IspF基因的克隆与功能分析

采用RACE技术,从银杏中获得MEP途径中的第5个酶2-C-甲基-D-赤藓醇-2,4-环焦磷酸合成酶(IspF)基因的全长cDNA,命名为GbIspF(GenBank登录号:EF062579).该基因cDNA全长为897 bp,包含720 bp的开放阅读框,编码239个氨基酸残基的蛋白,在GbIspF的N-端有一个长为59个氨基酸残基的质体转运肽;序列多重比对表明GbIspF与其他植物IspF同源.利用半定量RT-PCR对GbIspF进行组织表达谱分析,结果表明GbIspF在银杏根、茎、叶、果中均有表达,但表达量差异较大,在叶中表达量最高,在根中表达量最低.功能互补分析表明GbIspF能推动工程菌XL1-Blue pTrcGbIspF pAC-BETA超量表达β-胡萝卜素,在颜色互补平板上呈现β-胡萝卜素特有的橘黄色,证实GbIspF具有典型的IspF基因功能.     

甘薯不同外植体体细胞胚的发生及植株再生(英文)

[目的]分别以甘薯品种徐薯22的叶片与茎尖作为外植体,研究利用不同外植体通过体细胞胚胎再生途径得到再生植株的方法。[方法]将徐薯22的叶片和茎尖分别置于MSB和MSD培养基中诱导胚性愈伤,再将胚性愈伤置于MS培养基培养,观察体细胞胚的发生情况,最后对不同外植体得到的植株再生频率进行比较。[结果]用叶片作为外植体得到的胚性愈伤平均诱导频率为95.69%,而茎尖的则为30.56%;不同外植体在体细胞胚发生途径中的形态特征有一定差异;用叶片作为外植体的植株再生频率为60.61%,用茎尖的则为22.00%,且采用不同外植体诱导得到的再生植株无形态变化。[结论]在该试验中,体细胞胚的发生及植株再生的最适外植体为甘薯品种徐薯22的叶片。     

1种提取产紫杉醇内生真菌高质量核酸的方法

介绍1种从产紫杉醇真菌中快速提取高质量DNA和RNA的方法.该方法由传统CTAB法改进而来,包括抽提液试剂浓度的提高、纯化步骤的改进和离心力的增加等,有效保证了细胞杂质的清除和核酸质量的提高.使用该方法能在24h内提取高质量的核酸,为进一步开展产紫杉醇真菌的分子生物学研究奠定了基础.     

非化学处理对玉米象成虫的控制作用初探

通过试验初步研究半导体激光、紫外线以及与植物精油结合处理等非化学处理对玉米象成虫的控制作用;结果表明:低功率范围的半导体激光处理对玉米象的控制作用不佳;紫外线照射各处理组对玉米象均表现出一定的控制作用,其中254nm 20min处理组玉米象死亡率最高,并在第4d、5d与其它各组达到显著差异;物理、生物结合处理对玉米象成虫的控制作用较好,紫外(254nm 20min) 枫杨处理组最好,从第2d开始起表现出最有效的控制作用,且与其他各组差异显著,在第4d、第5d时死亡率达到了100%;非化学处理对玉米象有较好的处理作用,结合处理效果更佳,控制机理和具体参数有待于进一步研究.     

基于草甘膦筛选的菘蓝转化体系的建立

介绍了以菘蓝草甘膦筛选的遗传转化体系,以携带植物表达载体pASM12的根癌农杆菌LBA4404对四倍体菘蓝进行叶盘法转化,在选择培养基中加入8 mg/L的草甘膦进行筛选,获得草甘膦抗性的再生植株,对再生植株进行PCR检测和草甘膦抗性试验,结果表明:PCR检测表明子叶的转化频率达30%,下胚轴的转化频率达40%;对PCR阳性植株的草甘膦抗性试验表明,多数植株在不同程度上表现出对草甘膦的抗性。