三疣梭子蟹新品种“黄选1号”的选育

2005年收集鸭绿江口、莱州湾、海州湾、舟山4个三疣梭子蟹野生地理群体,构建核心育种群体,评估有效群体含量,制定合理保种模式;在5％留种率下,采用群体选育方法进行新品种培育.到2010年经过连续5个世代选育,形成特征明显、性状稳定的三疣梭子蟹新品种“黄选1号”.在相同养殖条件下与商品苗种进行对比测试.“黄选1号”收获时平均个体体重提高20.12％,成活率提高32.00％,全甲宽变异系数小于5％“黄选1号”新品种2010～2012年进行中试养殖200余hm2,养殖方法以“蟹、虾、贝、鱼”多品种生态养殖为主.结果显示,新品种收获时个体规格大、成活率高、整齐度好,平均单产提高30％;已推广到山东、河北及浙江等地,累计养殖面积6 000余hm2,获得较显著的经济效益和社会效益.     

三疣梭子蟹遗传连锁图谱的初步构建

利用AFLP和SSR标记技术结合"拟测交"策略,以三疣梭子蟹莱州湾、舟山野生群体杂交(1♂×3♀)产生的F2代家系为作图群体,初步构建了三疣梭子蟹雌、雄性遗传连锁图谱。用经过筛选的60对AFLP引物和3对SSR引物对亲本及108个F2代个体进行遗传分析,共得到母本分离标记214个,其中155个标记(AFLP标记153个,SSR标记2个)符合1∶1孟德尔分离规律;父本分离标记195个,139个标记(AFLP标记138个,SSR标记1个)符合1∶1孟德尔分离规律。雌性图谱包括100个遗传标记,分布在9个连锁群,6个三联体,15个连锁对,图谱总长度为1544cM,标记平均间隔22.0cM,总覆盖率为52.9%。雄性图谱包括71个遗传标记,分布在6个连锁群,6个三联体,11个连锁对,图谱总长度1174.2cM,标记平均间隔24.0cM,总覆盖率为49.5%,图谱中遗传标记分布比较均匀。     

三疣梭子蟹F型ATP酶β亚基(F-ATPaseβ)基因的克隆、组织表达及在家系近交中的变化

采用RACE技术(cDNA末端快速扩增技术)克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)F型ATP酶β亚基(F-ATPaseβ)基因,命名为ptF-ATPaseβ。该基因cDNA全长为1965 bp,5'和3'非编码区分别为571 bp和341 bp,开放阅读框为1053 bp,推测编码350个氨基酸,预测分子量为37.9 kDa,理论等电点为4.86。ptF-ATPaseβ氨基酸序列含有F1-ATPaseβ标志性蛋白结构域、AAA结构域和ATP-synt-ab-C结构域。同源性及系统分析显示,ptF-ATPaseβ氨基酸序列与斑节对虾(Penaeus monodon)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性高达89%。实时荧光定量PCR显示,ptF-ATPaseβ基因在肝胰腺、肌肉、心脏、鳃、胃、肠、精巢和卵巢中均有表达,其中,在肝胰腺和心脏中表达量最高,在肠中最少。随着近交系数的增加,各代ptF-ATPaseβ基因的表达量在肝胰腺和心脏中均下降且显著低于F0代(P0.05)。酶活检测结果显示,心脏中的ATP合酶活性从F6代开始出现下降且显著低于F0代(P0.05),但肝胰腺中ATP合酶活性无显著变化。本研究结果表明,近交造成了三疣梭子蟹ptF-ATPaseβ基因表达及ATP合酶活力的衰退。     

低盐度对不同三疣梭子蟹群体幼蟹发育的影响

对野生三疣梭子蟹Portunus trituberculatus亲蟹繁育的Ⅱ期幼蟹进行低盐度胁迫,发现其120 h的半致死盐度为11.7,并比较了“黄选1号”三疣梭子蟹和低盐适应群体三疣梭子蟹在低盐度（11.7）水中和正常海水（盐度为35.0）中的存活率、变态率和生长状况.结果表明：“黄选1号”在盐度为11.7时的存活率比在正常海水中低,低盐适应群体在盐度为11.7时的存活率与在正常海水中差异不明显;在盐度为11.7的水中,两个群体幼蟹的变态率与生长指标均低于在正常海水中.试验结束时,“黄选1号”在低盐度（11.7）水中的存活率、变态率、全甲宽分别为20.00％、10.00％、（17.47±1.11） mm,在正常海水中的存活率、变态率、全甲宽分别为52.22％、53.33％、（20.43±1.21）mm;低盐适应群体在低盐度（11.7）水中的存活率、变态率、全甲宽分别为32.22％、13.33％、（17.69±0.93） mm,在正常海水中的存活率、变态率、全甲宽分别为27.98％、16.67％、（18.79±1.61） mm.研究表明,低盐适应群体抵抗低盐胁迫的能力较强,在正常海水中“黄选1号”幼蟹的存活率、变态率、全甲宽和体质量均高于低盐适应群体.     

三疣梭子蟹野生群体同工酶的遗传多态性分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直电泳技术对三疣梭子蟹野生群体的同工酶进行检测.分析了48个样本的11种同工酶在三疣梭子蟹肌肉中的表达情况.11种同工酶(MDH、LDH、ME、SOD、 EST、SDH、IDH、ADH、POD、CAT、AAT)共检测出20个基因座位,其中Me-2、Sod-3、Cat-3、Ldh-2共4个座位呈多态(P0.99),多态座位百分数P为20%.平均每个座位的有效等位基因数目Ae为1.230,预期杂合度He为0.094,实际杂合度Ho为0.175.同时还分析了三疣梭子蟹4个多态座位的Hardy-Weinberg遗传偏离指数d.与日本绒螯蟹、中华绒螯蟹等相比,三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较高,种质资源还处于较好的状态.     

日本蟳形态性状对体重的影响效果

随机选取莱州湾日本蟳Charybdis japonica野生个体96只,分别测量了其额宽（X1）、甲长（X2）、甲宽（X3）、体高（X4）、全甲宽（X5）、大螯不动指高（X6）、大螯长节长（X7）、大螯不动指宽（X8）、大螯不动指长（X9）、第一步足长节高（X10）、第一步足长节长（X11）、第一侧齿间距（X12）、第二侧齿间距（X13）、体重（Y）共14个形态学指标。采用相关分析和通径分析的方法,计算了以形态性状为自变量对体重作因变量的相关系数、通径系数、决定系数及相关指数,定量分析了形态性状对体重的影响效果。结果表明：日本蟳的14个形态性状与体重的相关系数达到极显著水平（P〈0.01）;通径分析揭示了多元分析中多个自变量与因变量的真实关系,甲长、甲宽、第二侧齿间距对体重的通径系数达到显著水平,是直接影响体重的重要指标,其中甲长对体重的直接影响（1.060＊＊）最大,是影响体重的最主要因素,而第二侧齿间距对体重的直接影响是反向的;决定分析的结果与通径分析结果的变化趋势一致。所选形态性状与体重的复相关指数为R2=0.886,说明影响体重的主要自变量指标已经找到;通过多元回归分析,建立了甲长、甲宽、第二侧齿间距对体重的回归方程Y=10.028X2＋1.962X3-3.662X13-330.271,为日本蟳的育种提供了理想的测度指标。     

脊尾白虾丝氨酸蛋白酶抑制剂基因克隆及表达分析

采用RACE方法获得了脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)丝氨酸蛋白酶抑制剂serpin基因的cDNA序列。该基因全长1 516 bp, 开放阅读框1 245 bp, 编码414个氨基酸, 其预测分子量为45.06 kD, 理论等电点为5.694, 并含有两个糖基结合位点。同源性分析发现其与斑节对虾(Penaeus monodon)同源性最高, 达到49%。组织表达分析表明, serpin基因在脊尾白虾血细胞中表达量最高, 其次是肝胰腺和鳃组织, 在肌肉中表达量最低。不同盐度胁迫后脊尾白虾的血细胞serpin基因表达量在盐度胁迫8 h时显著高于对照组(P<0.05), 肝胰腺组织中serpin基因表达量在盐度胁迫后2 h和24 h出现明显峰值, 且显著高于对照组(P<0.05)。上述结果表明, 脊尾白虾serpin基因参与了急性盐度胁迫下机体的应激反应。本研究通过克隆脊尾白虾酚氧化酶原激活系统中的丝氨酸蛋白酶抑制剂基因cDNA全长, 分析盐度胁迫后其在血细胞和肝胰腺组织中的表达变化规律, 以期为脊尾白虾的健康养殖提供理论基础和参考依据。

     

三疣梭子蟹多态性微卫星DNA标记的筛选及评价

根据前人FIASCO方法构建的三疣梭子蟹微卫星富集文库,对含微卫星的DNA序列设计了71对引物并对其进行了多态性筛选,筛选出21对多态的微卫星引物,对三疣梭子蟹1个野生群体的30个个体进行遗传多样性检测,同时对引物进行评价。21个位点共获得了188个等位基因,平均每个位点扩增得到8.9个等位基因。不同引物获得的等位基因数差异较大,从3～13个不等,其中Pot8、Pot37、Pot48、Pot53、Pot54、Pot66六个位点分别获得了11、12、12、11、13、11个等位基因,而Pot46仅获得了3个等位基因。等位基因的大小分布在131～312bp,基本符合引物设计时理论产物长度。21个微卫星位点的期望杂合度的范围为0.659～0.889,PIC值均高于0.5,表明它们都有很高的杂合度,均可用于三疣梭子蟹种群遗传结构分析,为三疣梭子蟹品种选育、种系评估提供更多的微卫星DNA信息。     

三疣梭子蟹微卫星标记与生长相关性状的相关性分析

选用35个多态性微卫星标记,对三疣梭子蟹人工选育快速生长自交家系F2代(以2008年莱州湾群体雄蟹为父本和海洲湾群体雌蟹为母本交配产生F1代,随机选取F1代后代进行交配产生F2代自交家系)的110个个体进行遗传多样性研究。结果表明:35个位点共检测出87个等位基因,各位点等位基因数为2~4个不等,平均有效等位基因数为2.2个,观测杂合度平均值为0.646 5,期望杂合度平均值0.513 0,多态信息含量平均值0.449 1。经卡方检验,多数位点显著(P<0.05)或极显著(P<0.01)偏离Hardy-Weinberg平衡。采用SAS 9.1中的一般线性模型(general linear model,GLM)对微卫星标记与生长相关性状(全甲宽、甲宽、甲长、体高、体质量、第Ⅱ侧齿间距、第Ⅰ步足长节长、大螯长节长)进行连锁分析。结果表明,Pot08位点与体质量、全甲宽、甲长、体高、第Ⅱ侧齿间距显著相关(P<0.05),Pot42位点与体质量、甲长、大螯长节长、第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),Pot53位点与全甲宽、甲宽、大螯长节长显著相关(P<0.05),与第Ⅱ侧齿间距极显著相关(P<0.01),Pot57位点与第Ⅰ步足长节长显著相关(P<0.05),PTR8a位点与第Ⅰ步足长节长、体高、甲长显著相关(P<0.05),与体质量、第Ⅱ侧齿间距、全甲宽、甲宽极显著相关(P<0.01),PTR30位点与体质量和甲长显著相关(P<0.05),PTR131位点与体质量、全甲宽、甲宽显著相关(P<0.05)。其中,位点PTR8a可作为以体质量为选育目标的首选标记。     

三疣梭子蟹GST基因的cDNA克隆及表达分析

取健康三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)‘黄选1号’80日龄幼蟹,体重(32.66±6.27)g。通过RT-PCR及Smart-TM Race技术,克隆了三疣梭子蟹谷胱甘肽S-转移酶(glutathiones-transferase,简称GST)基因c DNA全长序列(Gen Bank登录号:KF781517)。GST基因全长1 010 bp,编码一个由216个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点PI为5.294,分子量为24.59 k D。氨基酸序列中含有GST基因家族特有GST-N结构域和GST-C结构域。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹GST基因与中华绒螯蟹(Eriocheir sinesis)和脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)的同源性分别为78%和63%。实时荧光定量PCR结果表明,GST基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高(P0.05),其次是鳃(P0.05),在心脏中表达最少。三疣梭子蟹肌肉注射低、中、高3个剂量组的磺胺嘧啶后,GST基因表达较对照组都有表达,均呈现先升高后降低再升高的趋势。同时,随着药物浓度的增加,低、中、高3个剂量组峰值出现的时间越晚,分别为6 h、24 h和48 h。本实验结果表明,磺胺嘧啶可以诱导三疣梭子蟹GST基因表达,GST基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。