三疣梭子蟹钙调蛋白基因的克隆及在蜕皮中的功能分析

基于转录组数据库信息,采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)钙调蛋白基因(PTCaM)。该基因cDNA全长1981 bp,包含450 bp的开放阅读框,编码149个氨基酸,预测分子量16.8 k D,理论等电点为4.09。对序列进行生物信息学分析发现,PTCaM是一个高度保守的序列,具有EF家族典型的EF-hand钙离子结合域。同源性分析结果表明,PTCaM基因编码的氨基酸与果蝇和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)的Ca M氨基酸序列覆盖率高达100%,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)、克氏原螯虾(Procambarus clarkia)和仿刺参(Apostichopus japonicus)覆盖率高达99%。系统进化表明,PTCaM基因氨基酸序列与凡纳滨对虾、中华绒螯蟹和克氏原螯虾聚为一支。通过分析不同蜕皮时期各个组织中PTCaM的表达情况得知,该基因在蜕皮时期的各个组织中均出现差异性表达,并且差异显著,说明该基因参与蜕皮调控过程。     

日本蟳4个地理群体遗传变异的同工酶分析

采用聚丙烯酰胺不连续凝胶垂直电泳技术对中国沿海的大连黑石礁、山东莱州湾、江苏海州湾和浙江象山4个日本蟳地理群体的10种同工酶进行检测,并分析了群体间的生化遗传差异。实验共记录了28个座位,其中m-Mdh-1、Sod-3、Cat-3、Est-1、α-Amy-1、α-Amy-4、Ldh-2、Alp-1和Alp-3共9个座位表现为多态,4个群体的多态座位百分数（P0.99）均为32.14%,平均每个座位等位基因有效值Ae为1.283 0～1.297 9,平均预期杂合度He为0.146 2～0.155 6,平均观察杂合度Ho为0.273 8～0.278 3,遗传距离D为0.000 4～0.001 8。4个群体的聚类分析表明,莱州湾和大连群体亲缘关系最近,而象山群体与其他3个群体遗传距离较远。实验结果表明,日本蟳遗传多样性处于较高水平,种质资源维持良好,有利于其种质资源的开发及遗传改良等工作的开展。     

利用16S rRNA和COI基因序列对三疣梭子蟹不同群体遗传特征的比较分析

采用PCR扩增技术对三疣梭子蟹日本北海道群体、韩国东海岸群体和我国山东即墨市会场村群体3个野生群体的16S rRNA和COI基因片段进行了扩增和测序,分别得到了长度为523和658bp的片段。通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了不同群体间的序列差异和遗传多样性水平。结果显示,我国会场三疣梭子蟹野生群体的遗传多样性水平较低。用MEGA4.0软件中的NJ法构建的分子进化树,基于16S rRNA片段构建的NJ系统树所反映的分类关系与基于COI基因片段构建的系统树并不一致,主要不同在于与日本蟳的分类关系上,基于16S rRNA基因片段构建的NJ系统树显示梭子蟹科的3个属聚为两大支:三疣梭子蟹不同的单倍型先聚在一起,再和梭子蟹属的远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚为一支;而青蟹属的3种蟹先聚在一起,再和日本蟳聚为一支。而基于COI基因片段构建的系统树显示,梭子蟹属先与青蟹属的两种蟹聚为一支,然后再与日本蟳聚在一起。本研究共发现19种单倍型,我国会场群体与日本北海道群体、韩国东海岸群体均有共享单倍型,表明我国会场群体与国外两个野生群体的遗传背景相似。这些资料为我国三疣梭子蟹的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据。     

盐度胁迫对三疣梭子蟹“黄选1号”血清部分生化指标的影响

为探明三疣梭子蟹"黄选1号"在盐度胁迫过程中血清生化指标的变化规律及特点,进而了解盐度适应过程中能量代谢机制,设置5、10、20和50共4个盐度组,以自然海水(盐度30)为对照组,进行三疣梭子蟹"黄选1号"盐度胁迫实验。结果显示,实验组血清葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)和总蛋白(TP)含量总体表现为先降低后稳定并显著低于对照组,对照组血清GLU、TG和TP含量在0~72 h内基本稳定,在整个盐度胁迫过程中,实验组血清GLU、TG和TP含量达到基本稳定后表现为与对照组盐度差值越大其含量降幅越大的特点。同一实验组三疣梭子蟹血清GLU和TP含量的最大降幅比TG含量的最大降幅大。各实验组血清GLU含量在0~9 h迅速降低,而血清TG和TP含量迅速降低发生在0~12 h。血清TP含量的最大降幅在盐度20实验组,但低于血清GLU含量最大降幅,在盐度5、10、50实验组内血清TP含量最大降幅高于血清GLU含量最大降幅。实验组血清尿素(UREA)含量总体表现为先升高后稳定并显著高于对照组,与血清GLU、TG和TP含量的变化趋势相反。盐度5和50实验组血清UREA含量相近,而血清TP含量则在盐度10与50实验组内相近。研究表明,三疣梭子蟹血清中GLU、TG和TP均与渗透压调节密切相关,在盐度适应过程中血清GLU和TP是三疣梭子蟹渗透调节的主要供能物质且血清GLU首先代谢供能,不同盐度下三疣梭子蟹血清GLU与TP对渗透调节供能占比有所不同,高盐环境中三疣梭子蟹血清自由氨基酸含量的部分增加可能来源于其他组织。     

盐度胁迫对三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸含量的影响

为探究不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸(free amino acids,FAAs)的含量及浓度的变化规律,明确FAAs的组成以及在盐度适应中发挥的作用,丰富FAAs在甲壳动物盐度适应领域的研究,为后续分子机理的研究提供依据,实验设定胁迫盐度分别为10、20、40、50,以正常海水(盐度33)为对照,用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定三疣梭子蟹血淋巴与肌肉组织中游离氨基酸的组分,分析不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中FAAs的含量及变化规律。结果显示,在正常海水中三疣梭子蟹血淋巴和肌肉中含量较高的FAAs主要为牛磺酸(Tau)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)。盐度为10~50,梭子蟹肌肉和血淋巴总游离氨基酸(total free amino acid,TOFAA)的含量随盐度的增加而显著升高,非必需氨基酸(non-essentical free amino acid,NEAA)的含量随盐度的升高而上升,而必需氨基酸(essentical free amino acid,EAA)的含量变化不显著,因此,TOFAA在渗透压调节方面的作用主要取决于NEAA。发挥主要渗透压调节作用的FAAs为脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。Ala、Gly、Asp、Glu属于鲜味氨基酸(taste amino acid,TAA),研究表明,NEAA中的TAA在渗透压调节方面作用显著,Pro含量的升高对TOFAA含量的增加作用显著,盐度为40~50尤甚,表明Pro在梭子蟹高渗调节中发挥重要作用。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,Pt DNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后Pt DNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因1的克隆及功能鉴定

为丰富三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶基因家族的组成,进行了几丁质酶基因1(PtCht1)的研究。PtCht1基因cDNA全长为2220 bp,编码583个氨基酸。结构域比对发现,PtCht1含有甲壳动物几丁质酶GH18家族基因的基本结构及保守序列,且进化树显示,三疣梭子蟹Cht1与拟穴青蟹(Scylla serrata)等物种的Cht1聚为一类,同源性最高,达92.80%。由此确定,PtCht1为甲壳动物GH18家族Group1基因,也是三疣梭子蟹该分类下的首个基因。此外,全组织表达分析结果显示,PtCht1在肝胰腺中较特异性高表达,且在蜕皮间期的肝胰腺中的表达量显著高于前期和后期(P<0.05)。低盐度胁迫处理后,在肝胰腺中,PtCht1基因的表达量在3 h快速升至峰值,为对照组的2.72倍;在鳃中,除12 h外,PtCht1基因的表达量均呈显著上调表达(P<0.05),最高上调9.96倍。结果表明,PtCht1基因能够参与机体对几丁质类食物的消化过程,并且在渗透压的调控等方面发挥重要作用。本研究可为三疣梭子蟹几丁质酶GH18家族Group1基因的研究奠定基础,为解析盐度影响三疣梭子蟹生长提供参考。     

三疣梭子蟹C-JUN氨基末端激酶基因克隆及在病原胁迫后的表达特征分析

C-JUN氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)作为丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)超家族的重要一员,在细胞增殖、凋亡和免疫应激等过程中发挥着重要作用。为深入研究JNK基因的免疫防御机制,本研究从三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)转录组数据库中筛选到JNK基因的EST序列,利用RACE扩增技术克隆得到该基因全长序列,命名为PtJNK,cDNA全长为3240 bp,开放阅读框(ORF)为1380 bp,编码459个氨基酸,具有TPY磷酸化位点的S_TKC保守结构域,是JNK基因家族典型特征。组织表达分布结果显示,PtJNK基因在所有组织中均有表达;Real-time PCR检测不同病原刺激下PtJNK基因的表达水平,结果显示,注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)后,该基因显著下调表达(P<0.05);而注射白斑综合征病毒(WSSV)后,该基因显著上调表达(P<0.05)。综上所述,PtJNK基因是一种广泛表达基因,且在不同的病原感染情况下,该基因的表达模式存在差异,在免疫防御过程中具有重要作用。     

三疣梭子蟹“黄选1号”盐度耐受性分析

通过盐度突变和渐变两种方法测定了三疣梭子蟹"黄选1号"的盐度耐受性。盐度突变条件下,Ⅱ期幼蟹24、48、72h低盐半致死浓度分别为21.655、22.109、23.184;高盐半致死浓度分别为50.711、50.061、49.612。80日龄成蟹24、48、72h低盐半致死浓度分别为5.13、7.49、8.56;高盐半致死浓度分别为54.49、52.74、52.21。在逐渐降低盐度条件下,Ⅱ期幼蟹可在盐度6.7的海水中存活,而80日龄成蟹可在盐度为5.7的海水中存活;随着盐度逐渐升高,Ⅱ期幼蟹和80日零成蟹均可在盐度47.7的海水中存活。三疣梭子蟹"黄选1号"具有较宽的盐度耐受范围。     

三疣梭子蟹两种标记技术

建立一种实用的标记方法,对更好地评价三疣梭子蟹增殖放流效果和良种选育工作非常重要。本实验采用注射可视嵌入性荧光、剪附肢两种手段对不同期别三疣梭子蟹进行标记,以研究标记的适用性及对个体生长的影响。对不同发育阶段三疣梭子蟹进行两个部位荧光注射,统计蜕壳后可识率。结果显示,II、III期幼蟹适合腹面区域注射,IV期以后适合游泳足基节和头胸甲背面的薄膜关节注射;标记后,经过两次蜕壳,识别率在80%以上,但3次蜕壳后,识别率较低;根据标记组、未标记组生长数据,通过单因素方差分析发现：标记对三疣梭子蟹个体生长无显著性影响。VII期以后的幼蟹,更适合剪附肢法,该法操作简单,识别率高,对个体生长、存活无显著性影响(P≥0.05)。因此本研究得出：将两种个体标记方法结合起来应用,更合理、更科学,为梭子蟹增殖放流、良种选育等研究提供有力的工具。