牛隐孢子虫卵囊分离和纯化方法的比较试验

运用3种粪便漂浮法、3种染色法和2种分离提纯法对10头犊牛的粪便进行卵囊检查、分离纯化，对这些方法进行比较。试验结果显示：饱和硫酸锌漂浮法结合姬姆萨氏染色法检查隐孢子虫卵囊，检出率最高、效果最佳；蔗糖密度梯度离心法分离纯化隐孢子虫卵囊。收集的卵囊最多，效果最好。     

鸭出血症血凝及血凝抑制试验的建立和应用

鸭出血症是由不同于鸭瘟病毒的鸭新型疱疹病毒引起的鸭的一种传染性疾病。根据该病毒可凝集Balh／c小鼠红细胞的特性，我们建立了鸭出血症血凝及血凝抑制试验，经试验表明该方法是一种快速、实用、特异性强的检测方法。     

四倍体高粱与约翰逊草杂交种饲用品质分析

利用四倍体高粱品系"四沈甜"、不育系"四6A"和约翰逊草,配置"四沈甜"×约翰逊草、"四6A"×约翰逊草和"四6A"×"四沈甜"杂交种,分析了杂交种及杂种分离世代的不同生长阶段的杂种优势及饲草品质。结果表明,在孕穗期各供试材料粗蛋白质含量最高,杂交种蛋白质含量达到10%～15%,随着发育期的推进,含量有所下降。抽穗期,粗脂肪含量达到6.1%～7.9%。各材料的粗纤维含量都在30%以上,不同生长阶段差异不显著。单位能量值在抽穗期最高,达到18MJ/kg左右。综合各营养成分含量和单位能量分析,初步认为四倍体高粱与约翰逊草杂交种可以作为饲草应用,抽穗期为刈割和利用的最佳时期。     

酵母多糖对环磷酰胺所致免疫损伤大鼠的拮抗作用

为研究酵母多糖(YP)对环磷酰胺(CTX)所致免疫损伤大鼠的拮抗作用,本实验将80只雄性SD大鼠随机分为YP(50 mg/kg)+CTX组、YP(100 mg/kg)+CTX组、YP(200 mg/kg)+CTX组、CTX对照组和正常对照组。YP+CTX组按剂量灌胃并称重,CTX和正常对照组则灌胃给予等量生理盐水,连续给药10 d;在第8 d、9 d,除正常对照组外,其余4组腹腔注射CTX 100 mg/kg。第11 d采血及对相关的免疫器官组织进行检测。结果显示,YP(100 mg/kg)组平均日增重和饲料报酬比正常对照组显著增加(p<0.05);胸腺指数,血清中IgA、IgG、表皮生长因子(EGF)、碱性磷酸酶(AKP)含量及空肠SIgA水平显著(p<0.05)或极显著(p<0.01)高于CTX对照组;结肠壁中前列腺素E2(PGE2)含量与CTX对照组相比显著降低(p<0.05)。以上结果表明,YP能提高大鼠的生长性能;YP对CTX所致免疫损伤具有一定的拮抗保护作用,其中100 mg/kg剂量的YP效果最为显著。     

超低温冷冻对小鼠桑椹胚多能性因子Oct-4表达的影响

本实验旨在探讨昆明白小鼠桑椹胚超低温冷冻后Oct-4表达的变化与胚胎发育潜力的关系。胚胎采用OPS法冷冻,即胚胎于10%EG+10%DMSO溶液中预处理30 s,然后再移入玻璃化溶液(EDFS30)中处理25 s,以OPS为承载器投入液氮中。毒性组胚胎未投入液氮,其他过程与冷冻组相同,新鲜胚胎为对照组。胚胎解冻后,检测Oct-4 mRNA与蛋白的表达,通过观察其形态正常率、囊胚发育率和囊胚细胞数来综合判断其体外发育能力。结果表明:冷冻组和毒性组较桑椹胚中Oct-4 mRNA的表达量对照组相比显著降低(P<0.05),蛋白表达量3组间无显著差异。桑椹胚处理后的形态正常率以及桑椹胚培养48 h后的囊胚发育率(96.67%～100%)和囊胚细胞数(89.67～92.33)3组间无显著差异。结果显示,玻璃化冷冻保存小鼠桑椹胚后多能性基因Oct-4 mRNA表达的变化并未影响其体外发育潜力。     

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。     

河南省部分地区猪流行性腹泻病毒ORF3和N基因的克隆及其遗传进化分析

为探究河南省猪流行性腹泻病毒部分毒株的遗传进化情况,采用RT-PCR对2017年2月至2018年1月在河南省部分地区猪场收集到的25份PEDV阳性病料进行ORF3和N基因的扩增,并对其进行克隆、序列比对及遗传进化分析。结果显示,PEDV毒株的ORF3基因序列是由675个核苷酸组成的,与经典毒株CV777之间核苷酸及氨基酸同源性分别为95.2%~97.5%和95.1%~96.9%。N基因之间的核苷酸与氨基酸同源性分别为96.2%~100%和93.8%~99.8%;与经典毒株CV777核苷酸与氨基酸的同源性分别为94.7%~95.8%和93.2%~96.8%。河南部分地区PEDV流行毒株与经典毒株CV777不在同一分支,说明猪场暴发猪流行性腹泻与免疫接种疫苗后依旧难以控制的原因,可能与大多数PEDV河南流行株发生变异有关。     

实时荧光定量PCR检测鸭疫里默氏杆菌方法的建立和应用

根据我们实验室发现的鸭疫里默氏杆菌（RA）荚膜多糖蛋白基因序列（DQ151838）,设计和合成荧光定量PCR引物和探针,建立了检测RA的实时荧光定量PCR方法。该法的表达式Y=-3.416X＋39.492,相关系数1.000,PCR循环效率96.2%,DNA拷贝数在10^0～10^8范围内检测曲线有良好的线性关系。该法的最适Mg^2＋、引物和探针浓度分别为4～5mmol/L、0.16～0.2μmol/L和0.16μmol/L,最低能够检测到RA的DNA模板为2.0copies/μL。1/10半数致死量的RA人工皮下注射感染7日龄樱桃谷鸭后2h即可在心、肝、肺、胸腺、食管中检测到RA核酸;感染后8h即可在心、肝、脾、肺、肾、脑、胰、食管、气管、胸腺、法氏囊、十二指肠、直肠、血液和咽喉拭子检测到RA核酸,36～120h是RA在感染雏鸭除了咽喉、食管和气管各个组织器官繁殖数量最高峰期,其后逐渐下降。RA人工感染致死雏鸭的心、肝、脑RA分离和FQ-PCR检测符合率为100%。对临床送检具有典型鸭疫里默氏杆菌病临床症状和病理变化的死亡雏鸭的肝脏、心血和脑组织的FQ-PCR检测的阳性率均为100%,而RA分离的阳性率分别只有74.3%（26/35）、82.9%（29/35）和91.4%（32/35）。FQ-PCR可用于鸭疫里默氏杆菌感染的快速诊断、流行病学调查和鸭产品的检疫等。     

禽流感病毒夹心ELISA快速检测方法的研究

以禽流感病毒(AIV)湖北分离株(H9N2亚型)提纯物为免疫原，制备出鸡抗AIV和兔抗AIV抗体，经用琼脂扩散法测得效价分别为1:32和1:16。以纯化的鸡抗AIVIgG为包被抗体，兔抗AIVIgG为第二抗体，建立了检测AIV抗原的夹心ELISA法。结果表明，鸡抗AIVIgG的最佳包被浓度为1μg/mL，兔抗AIV IgG的最适工作浓度为5μg/mL；对已知的阳性样品，用夹心ELISA法测得的病毒滴度比血球凝集滴度高16倍以上，且能检出其它亚型的禽流感病毒；与新城疫病毒、传染性支气管炎病毒、减蛋综合征病毒、传染性喉气管炎病毒、传染性法氏囊病病毒、鸡痘病毒、马立克氏病病毒等无交叉反应，说明本方法有很高的特异性及敏感性。对14个鸡场送检的、患有呼吸道疾病或有腹膜炎、眼炎、产蛋下降、怀疑为禽流感感染的病鸡进行了检测，结果有7个鸡场为阳性。本方法的建立为禽流感病鸡群的临床检验提供了一种方便、敏感、快速的检测方法。     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒噬菌体单链抗体库的构建和筛选

为筛选牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）gP48蛋白的单链抗体,本研究利用噬菌体展示技术构建了gP48蛋白单链抗体克隆文库,通过微孔筛选法对抗体库进行3轮富集淘筛,利用ELISA技术测定单链抗体的亲和力,对亲和力较高的克隆进行基因测序分析和结合活性测定,旨在获得gP48蛋白的单链抗体。结果表明：1）成功构建了库容量为4.3×107的噬菌体单链抗体库,其重组率为83.3%,经三轮筛选对噬菌体抗体库进行富集,富集倍数为1.43×104;2）优化了间接ELISA方法,筛选到3株与BVDV gP48蛋白具有高亲和力的单链抗体以及其基因序列,通过IgBLAST分析显示,3株单链抗体均为鼠源IgG。综上,从gP48蛋白的单链抗体库中筛选获得3个具有高亲和力的单链抗体,可用于后续BVDV检测方法的建立。