转基因技术,猪品种改良的新希望

本文简介了我国猪品种培育存在的问题和传统育种方法的不足之处,以及转基因技术在猪品种改良方面的优势,并介绍了及转基因技术在提高猪的饲料利用率、抗病能力和用于人类疾病治疗方面的发展。     

基于CRISPR/Cas9技术的Wip1基因敲除ST细胞的建立

旨在采用CRISPR/Cas9编辑系统获得Wip1基因敲除的猪睾丸（swine testis,ST）细胞,为后续在细胞水平上探究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响奠定基础。本研究将实验室已有的靶向Wip1基因第一外显子的两条sgRNA（sgWip1-1和sgWip1-2）分别连接到pX330-GFP和pX330-RFP载体,然后共转染ST细胞（从80~90日龄的猪胚胎睾丸组织中分离出未成熟的支持细胞）。利用流式细胞仪收集红绿双荧光阳性的ST细胞,以用于单克隆细胞挑选。对得到的30个单克隆细胞进行基因型鉴定,并将PCR产物进行T-A克隆。结果显示,有29个单克隆细胞出现了基因片段敲除,Wip1基因的片段敲除效率为96.7%。其中单等位基因片段敲除的有5个,纯合双等位基因片段敲除的有8个,杂合双等位基因片段敲除的有16个。本研究高效地构建了Wip1基因敲除的ST细胞,不仅为后续研究Wip1基因对ST细胞增殖、凋亡的影响提供了细胞模型,也为研究Wip1基因对公猪繁殖性能的影响奠定了基础。     

猪卵丘卵母细胞复合体和裸卵的卵母细胞发育及基因表达差异的研究

卵丘细胞是指包裹在卵母细胞外周并与之进行代谢联系的颗粒细胞群,是一类与生殖细胞密切相关的体细胞。大量研究表明,卵丘细胞在卵母细胞的发育、成熟、排卵、受精以及受精卵发育过程中发挥了重要作用,卵母细胞与卵丘细胞之间的相互作用已成为关注的焦点。由于卵丘与卵母细胞之间的相互作用十分复杂,人们对参与这一细胞间互作的信号通路和反应过程相关基因的表达还缺乏深刻了解。本研究对比了有致密完整卵丘细胞包裹的卵母细胞和无卵丘细胞包裹裸卵的体外培养成熟过程中的成熟率、孤雌激活卵裂率、囊胚率的差异,并运用mRNA差异显示技术(DDRT-PCR)和半定量RT-PCR技术,比较了两者在基因表达上的差异,目的是进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理。材料与方法:采集大量猪的卵母细胞,捡出A级卵(胞质均匀且卵丘细胞层完整紧密,包裹五层以上的卵)和C级卵(有极少或无卵丘细胞包裹的卵)分别进行了体外培养、孤雌激活。同时对两类卵母细胞抽提RNA,进行DDRT-PCR,筛选出差异条带进行克隆测序,最后根据测序结果设计特异引物,最后通过半定量RT-PCR对筛选出的差异条带进行验证。结果与讨论:(1)在体外培养和成熟实验中,卵丘卵母细胞复合体(COC)中的卵母细胞的成熟率和卵裂率均显著高于裸卵的,而裸卵的囊胚率为0,表明卵丘细胞在卵母细胞的发育和成熟过程中起到了关键作用。(2)利用了3对锚定引物和随机引物,共发现了16条差异表达的片段,经过克隆测序最终得到了14条差异表达的序列,经过比对发现,其中3个片段分别与人的PELP1,Myo5b,calpastatin基因高度同源,另外5条序列与猪的EST同源,但功能未知,其余6条序列未找到同源片段。(3)经过半定量RT-PCR验证表明,大约有一半的条带在差异显示和半定量RT-PCR实验中的结果一致,其中PELP1,Myo5b基因在有卵丘细胞的卵母细胞中的表达量高于裸卵的,而calpastatin基因只在有卵丘细胞的卵母细胞中表达,在裸卵中则没有检测到。(4)相关研究表明,差异表达基因在雌激素受体的调节、细胞膜间的信息传导、细胞器物质运输等过程中发挥重要的作用,这些差异基因可能参与了卵丘细胞与卵母细胞间的相互作用,对卵母细胞的成熟具有重要作用。上述研究为进一步认识卵母细胞的发育机制,并推测卵母细胞和卵丘细胞间的相互作用的分子机理奠定基础。这些差异表达的基因也是卵母细胞成熟过程中的关键因子,可以作为筛选卵母细胞进行下一步操作的标记基因。     

不同类型的转基因细胞为核供体生产猪的转绿色荧光蛋白基因克隆胚胎

2005年我国获得了体细胞克隆猪的成功,但是在体细胞转基因克隆猪方面还处于起步阶段。猪的转基因克隆在农业和医学方面有着巨大的应用前景,在农业上可以提高猪肉品质和培育抗病猪种等;医学上可以为人类异种器官移植、疾病模型和新药筛选提供理想材料。体细胞核移植结合基因组修饰技术,是目前生产转基因家畜的一种有效方式。供体细胞的类型是影响转基因克隆效率的一个关键因素,因为供体细胞的类型决定着体细胞转基因效率和重组胚的发育潜力。目前所知,较成功用于生产转基因克隆猪的供体细胞仅限于胎儿成纤维细胞,因为它易培养、增殖期限长、重构胚的发育能力高。此外骨髓间充质细胞,一种成体干细胞,作为转基因克隆猪的供体细胞有着巨大的潜力,国内外仅有个别报道。前脂肪细胞,一种易于获得的体细胞,有报道称利用成年猪前脂肪细胞为核供体构建的克隆胚发育能力和胎儿成纤维细胞相当,并且获得了克隆猪的后代。而利用猪前脂肪细胞生产转基因克隆胚胎,将为后续组织工程研究奠定基础。因此本研究选择猪胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞为转基因克隆的供体细胞,目的是比较不同类型转基因供体细胞对生产克隆胚胎效率的影响。本研究首先建立了近交系五指山小型猪(WZSP)胎儿成纤维细胞系(FF)、新生猪骨髓间充质细胞(MSCs)系和成年猪前脂肪细胞系(PreA)。采用组织块法建立胎儿(27日龄)成纤维细胞系;髓间充质细胞从新生猪后腿骨冲取骨髓,加入到Percoll分离液中离心,吸取中间界层面细胞,贴壁法培养骨髓间充质原代细胞,培养基为低糖DMEM。对间充质细胞向脂肪细胞进行诱导分化,油红O染色鉴定;前脂肪细胞从猪的皮下脂肪取样,用0.1%胶原酶消化法建立前脂肪细胞原代细胞,并对前脂肪细胞进行诱导分化为成熟的脂肪细胞,油红O染色鉴定。为了获得转基因细胞系,利用脂质体lipofectamineTM2000(Invitrogene)介导的方法将质粒pEGFP-N1转染了胎儿成纤维细胞、骨髓间充质细胞和前脂肪细胞,经过800μg/mL G418筛选后均获得了阳性细胞株。分别以3种类型转基因和未转基因细胞为核供体进行猪的体细胞核移植,比较克隆胚胎的发育能力。结果如下:(1)比较了3种类型非转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(8.2%)、骨髓间充质细胞(7.1%)和前脂肪细胞(8.8%)囊胚发育率差异不显著(P>0.05);(2)比较了3种类型转基因细胞的重组胚的囊胚发育率,发现胎儿成纤维细胞(9.6%)和骨髓间充质细胞(9.9%)最高,前脂肪细胞(3.7%)最低,前两者与后者差异显著(P<0.05);(3)分别比较了每一类型供体细胞转基因和非转基因对重组胚的囊胚发育率的影响,转基因对胎儿成纤维细胞(9.6%vs 8.2%)和骨髓间充质细胞(9.9%vs 7.1%)的重构胚囊胚发育率影响不大(P>0.05);前脂肪细胞转基因重组胚的囊胚发育率显著降低(3.7%vs 8.8%,P<0.05)。以上结果表明,某些供体细胞类型转基因与否对猪克隆胚胎的早期体外发育影响不明显,有些细胞类型转基因对克隆胚的发育能力影响较大。通过体细胞核移植技术,猪胎儿成纤维细胞和骨髓间充质细胞可以有效地生产猪转基因囊胚,但前脂肪细胞转基因克隆胚胎的囊胚发育率能否进一步提高,还需要进一步的实验观察。     

文冠果育种和优良品种繁殖

文章从文冠果的有性繁殖、无性繁殖两方面详细介绍了它的多种培育技术,阐述了文冠果品种优选育的重要性及发展前景。     

塔里木河下游蝗虫调查初报

塔里木河下游系指恰拉水库到台特玛湖之间长428km地段。近年来随着塔里木河下游生态环境的改善,该地又形成了许多适宜亚洲飞蝗生存的环境,由于历史上塔河下游是亚洲飞蝗的重要发生区,所以再次发生亚洲飞蝗灾害的可能性极大。2006年6月15￣20日,笔者对塔河下游的蝗害情况进行了调查。     

猪孤雌激活胚胎的体外培养系统优化

胚胎体外培养的气相条件、培养基及生长因子是影响胚胎发育的关键因素。系统研究不同氧分压（7%O2和20%O2）和三种胚胎培养基(NCSU-23、 PZM-3、G3)及表皮生长因子(EGF)和碱性成纤维促进因子(bFGF）对孤雌激活胚胎的囊胚发育率及囊胚细胞数的影响。结果表明，与高氧(20%O2)条件相比，低氧条件下（7%O2）提高了胚胎的囊胚率和细胞数，有利于胚胎的发育。PZM-3能显著提高囊胚细胞数（P < 0.05，51.0±4.0 vs. 38.8±2.2），无论在高氧还是低氧下，PZM-3都是胚胎发育的一个效果稳定、高效的培养基。添加10ng/mL EGF或bFGF的NCSU-23对提高胚胎的囊胚发育率有显著效果（P < 0.05，36.2±5.3％，44.3±5.8％ vs. 20.7±6.3％），但不能提高囊胚细胞数（P > 0.05）。     

南美白对虾养殖的生态学管理技术探讨

南美白对虾淡化养殖技术在鲁西盐碱池塘获得很大成功。通过几年实践，在抓高产的同时，我们致力于探索对虾养殖的池塘生态学管理技术，目的是为了更加充分利用池塘生态系中物质能量流动规律，提高虾苗下塘成活率，把池塘生物能量更大限度地发掘出来，逐步实施生态养殖，获取绿色水产品，取得经济效益、生态效益双收，倡导渔业和谐生产。茌平县有低洼盐碱池塘800hm^2（1．2万亩），属黄河故道，池塘蒸发量大，盐度大多在1～32．间，而南美白对虾经淡化的虾苗正适宜这个盐度。     

外国元旦奇俗拾趣

外国元旦奇俗拾趣斗牛元旦：葡萄牙人以斗牛来迎接元旦。每年元旦的前后十天，是斗牛的高潮，成千上万的人涌向斗牛场，以看斗牛的勇武风姿为乐。埋物元旦：墨西哥有些地区元旦到来时，要在屋后挖一个很深的洞，把旧的东西埋进洞里，以示除旧迎新。大笑元旦：墨西哥的一些...     

密植矮冠苹果园

密植矮冠苹果园低温多雨年份需防疫腐病近年来，一些密植矮冠苹果园在多雨年份和季节，常出现大量烂果的情况。这是很多果农不认识的一种病害—疫腐病大发生的结果。随着果树向矮化密植方向的深入发展，该病害将成为值得重视的防治对象。疫腐病又称实腐病、颈腐病。可危害...