21日龄CD163基因编辑猪血液生理 生化及免疫指标的测定和分析

探讨了CD163基因编辑对21日龄断奶仔猪前腔静脉血液中部分生理生化、免疫球蛋白及补体蛋白等指标的影响。结果表明:CD163基因编辑后,纯合子的淋巴细胞比率、中间细胞比率、红细胞平均体积均显著低于杂合子和阴性猪(P0.05);纯合子的粒细胞比率、粒细胞数显著高于杂合子和阴性猪(P0.05);杂合子的血小板总数显著高于纯合子和阴性猪(P0.05);纯合子的葡萄糖和胆固醇含量显著高于杂合子和阴性猪(P0.05);纯合子血液中IgG、IgA、IgE和IgM等4类免疫球蛋白的含量均显著高于杂合子和阴性猪(P0.05);纯合子血液中补体蛋白3和补体蛋白4与杂合子和阴性猪没有显著性差异(P0.05)。     

CD163双等位基因编辑猪的制备及传代

【目的】猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS）,俗称“蓝耳病”,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）引起的一种高致死性传染病,对世界养猪业造成了巨大的经济损失。由于PRRSV遗传变异性较大,因此国内外并未有理想疫苗能够对此病进行有效防制。Cluster of differentiation 163（CD163）是PRRSV感染猪肺泡巨噬细胞（porcine alveolar macrophage, PAM）的受体之一,研究旨在利用CRISPR/Cas9技术结合体细胞核移植技术制备CD163基因编辑的大白猪。【方法】针对猪CD163基因的第7外显子设计构建CRISPR/Cas9基因编辑载体;转染大白猪胎儿成纤维细胞,获得基因编辑阳性细胞克隆;以基因编辑细胞为核供体、体外成熟的猪卵母细胞为核受体构建克隆胚胎;胚胎移植到受体母猪生产CD163基因编辑猪,并进行后续的扩繁试验。【结果】设计的gRNA能够高效的识别靶位点。对获得的127个细胞单克隆进行PCR和测序显示,共有21个克隆发生突变,其中14个克隆为单等位基因突变或双等位基因杂合突变,7个克隆为双等位基因纯合突变。通过体细胞核移植技术,成功获得了CD163双等位基因编辑的纯合大白猪;并获得首批F₁代CD163基因编辑仔猪,目前健康状态良好。随后将有更多的F₁代CD163基因编辑猪陆续出生。【结论】制备的无抗性筛选标记的CD163双等位基因编辑猪,能够安全并快速地为培育抗PRRSV新品种猪提供育种材料。     

水体铬暴露对南方鲇生长、代谢和铬累积分布的影响

以南方鲇(Silurus meridionalis Chen)幼鱼(19.75±0.12 g)为研究对象,以K_2Cr_2O_7作为毒物源,在(27.5±0.5)℃条件下分别进行了急性暴露和慢性暴露的毒理效应实验。通过急性暴露实验,测得该种鱼的96h半致死浓度值(96 h LC_(50))为56.24 mg/L。在水体Cr浓度分别为0(对照组)、0.937 mg/L(96 h LC_(50)的1/60)和1.875 mg/L(96 h LC_(50)的1/30)条件下,进行了为期8周的慢性暴露实验。结果表明,实验鱼体的特定体重生长率、肥满度和肝脏指数随着Cr浓度的升高而显著降低,肾脏指数随Cr浓度的升高而显著升高;两个Cr浓度组鱼体的蛋白质和能量密度均显著低于对照组,(1/30)96 h LC_(50)浓度组鱼体的脂肪含量显著低于对照组,而前者的水分含量则显著高于后者。两个Cr浓度组鱼体的静止代谢率均显著高于对照组。经过8周水体Cr暴露处理后,实验鱼体的各器官组织中Cr的累积含量均显著高于对照组,其累积含量的顺序均为肾鳃肝肠全鱼脑肌肉;(1/60)96 h LC_(50)和(1/30)96 h LC_(50)浓度组的肾脏的Cr累积含量显著高于其他组织,肌肉的Cr累积含量均显著低于其他组织;鳃组织中Cr含量相对于对照组的增加幅度大大高于其他组织的增幅。     

游泳加速模式对南方鲇和团头鲂运动后代谢恢复的影响

为了探讨游泳加速模式对不同生态习性鱼类运动力竭后代谢恢复的影响,采用鱼类游泳呼吸测量仪,在(25±0.5)℃条件下,分别测定南方鲇(Silurus meridionalis)和团头鲂(Megalobrama amblycephala)爆发游泳加速模式(Uburst:Δv为20 cm/s,Δt为2 min)和持续游泳加速模式(Ucrit:Δv为10 cm/s,Δt分别为20、40和60 min)的运动后过量耗氧(EPOC)。结果显示:两种实验鱼的代谢恢复曲线均呈快速恢复和缓慢恢复两个阶段。南方鲇在Uburst后测得的EPOC恢复历时显著高于其它3个加速模式,而团头鲂4个不同处理组的EPOC恢复历时之间的差异均不显著;在相同的加速模式条件下,南方鲇的EPOC恢复历时均短于团头鲂。南方鲇在Uburst后的EPOC总量比3组Ucrit模式下的EPOC总量分别高286.6%、359.5%和816.5%,而团头鲂分别为20.6%、14.8%和29.0%。结果表明:南方鲇运动中对无氧代谢的依赖度高,爆发运动时动用无氧代谢的能力强,可以大幅度提升游泳速度,且运动后代谢恢复时间较短;团头鲂运动中主要依赖有氧代谢,可以保持较长时间的高速游泳,但运动后代谢恢复历时较长。     

CRISPR/Cas9介导的猪IPEC-J2细胞CD13基因敲除细胞系的建立

旨在利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术制备CD13基因敲除的IPEC-J2(猪空肠上皮细胞系)细胞,揭示细胞表面分化抗原13(cluster of differentiation 13, CD13)在肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用。本研究在猪CD13基因第2外显子区域设计2个向导RNA(guide RNA, gRNA),命名为g3、g5,然后分别将g3和g5克隆到pX330-GFP和pX330-RFP载体骨架上,电转染IPEC-J2细胞,48 h后通过流式细胞术分选具有双荧光标记的细胞,培养并获得单克隆细胞,PCR扩增、测序,从而获得CD13基因纯合敲除的阳性细胞系。对获得的20个细胞单克隆进行PCR,并挑取部分克隆PCR产物测序,发现共有7个克隆发生了基因片段缺失,其中1个克隆为单等位基因片段缺失,3个克隆为双等位基因杂合片段缺失,3个克隆为双等位基因纯合片段敲除。本研究检测双等位基因纯合片段敲除细胞的蛋白表达水平,其结果显示,在该纯合敲除细胞中CD13蛋白几乎不表达,表明成功构建了CD13敲除的IPEC-J2细胞系。本研究获得的CD13基因敲除细胞系为探究CD13在猪肠道病原微生物感染肠道细胞中所起的作用奠定了基础。     

五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型的建立和TLR2介导炎症相关因子的表达

【目的】探讨五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外分离培养和鉴定的方法,研究LPS对内皮细胞TLR2表达的影响及TLR2介导内皮细胞炎症因子的表达情况。【方法】以3—4月龄的五指山小型猪近交系为试验材料,取其胸腹主动脉,采用0.1%I型胶原酶消化分离主动脉内皮细胞。利用细胞吸收DiI-Ac-LDL试验和流式细胞仪检测CD31的特异表达两种方法进行内皮细胞的鉴定。1 μg•mL-1LPS刺激内皮细胞0、6、8和12 h,实时荧光定量PCR检测TLR2和TLR4的表达量;1 μg•mL-1LPS刺激内皮细胞12 h后,10 μg•mL-1LTA孵育0、6和12 h,实时荧光定量PCR检测炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的表达量。【结果】分离得到的主动脉内皮细胞呈铺路石样整齐排列,且生长状态良好;细胞膜上表达CD31分子和Ac-LDL的受体,证实分离得到的细胞是血管内皮细胞。LPS刺激后细胞TLR2 mRNA水平的表达量明显升高（P＜0.05）,而TLR4 mRNA水平表达量无明显变化。添加LTA孵育后,细胞炎症因子IL-6、IL-8和黏附分子ICAM-1的mRNA水平表达量较对照明显升高（P＜0.05）。【结论】成功建立了五指山小型猪近交系主动脉内皮细胞体外培养模型,并检测到TLR2在LPS刺激内皮细胞后表达量升高,能够介导细胞炎症相关因子的表达。     

乌兰察布市城市道路绿化植物的选择

城市道路绿化是城市园林绿地系统的重要组成部分,也是城市文明的重要标志之一。城市道路的绿化搞好了,不仅美化街景,而且还有净化空气、减弱噪音、除尘、防风等作用,同时,也会有一定的经济效益和社会效益。近年来,乌兰察布市加大了城市道路绿化力度,争创园林绿化城市,在城市道路绿化方面取得了可喜的成绩。     

五指山小型猪生长激素及其受体基因的克隆与序列分析

动物生长发育调控是一个高度复杂而精细的生理过程,受多种因素如神经、体液、遗传、营养及环境等的影响。其中,动物神经内分泌生长轴各因子(激素、受体、结合蛋白等)及其基因对动物的生长发育起着关键的作用。正常情况下,下丘脑接受体内外的信息,生长激素释放激素(grow thhorm one releasing horm one,GHRH)和生长抑素(som atostatin,SS),调节垂体生长激素(grow thhorm one,GH)的分泌,GH通过与生长激素结合蛋白(grow th horm one b ind ing protein,GHBP)结合而运输,与靶器官上的生长激素受体(grow th horm one receptor,GHR)结合,促使类胰岛素生长因子(insu lin-like grow th factors,IGFs)的产生并进入血液循环,IGFs再通过其结合蛋白(insu lin-likegrow th factor b ind ing protein,IGFBP)转运到全身组织细胞,促使组织细胞的生长与分化。五指山猪(Wuzhishan Pig,WZSP)是一种原产于中国海南省山区的小型猪。五指山猪成年体重仅为35 kg,是正常猪体重的15%~30%,是一种频临灭绝的珍稀物种。五指山猪具有以下特征:体型小,性成熟早,肉质好,耐近交和遗传稳定。为了开发和应用这一珍稀猪种的遗传资源,中国农业科学院北京畜牧兽医研究所从1989年就已经开始对五指山猪进行近交系培育,现在已经获得五指山猪近交系18代(近交系数为0.974),但五指山猪的矮小机理至今不明。为了探讨五指山猪矮小的分子机理,对五指山猪生长激素及其受体基因进行了克隆和序列分析。从纯种近交16代五指山猪的垂体和肝组织提取总RNA,根据GenBank中猪生长激素及其受体基因的序列(登录号分别为X53325,NM214254)设计特异性引物,对五指山猪生长激素及其受体基因进行扩增,然后对PCR产物进行回收、克隆测序。测序结果表明,五指山猪生长激素基因开放阅读框长651 bp,编码216个氨基酸,其中包含26个氨基酸的信号肽;生长激素受体基因编码区编码639个氨基酸,其中包含18个氨基酸的信号肽。运用生物学软件DNAssist 2.2将五指山猪和普通猪的生长激素基因编码区进行比对发现,五指山猪生长激素基因的编码区有4个突变:26号位置发生C→T突变,该突变导致缬氨酸代替丙氨酸;65号位置发生G→A突变,该突变导致谷氨酰胺替换精氨酸;114号位置发生T→C突变,252号位置发生A→G突变,但是这两个突变都未引起所编码氨基酸的变化。五指山猪和普通猪生长激素受体基因比对发现,1143号位置的G→T突变引起天冬氨酸替换谷氨酸;1225号位置的G→T突变导致丝氨酸替换丙氨酸;1666号位置C→G突变导致缬氨酸替换亮氨酸;1739号位置C→G突变导致丙氨酸被甘氨酸所代替;1801号位置G→A突变导致缬氨酸被异亮氨酸代替;1248号位置G→A突变,1287号位置G→A突变和1827号位置G→C突变均为同义突变,未引起相应编码氨基酸的变化。五指山猪生长激素基因有两处氨基酸替换,这两处替换发生在信号肽区,对成熟蛋白的结构和功能没有影响,但是有可能会影响蛋白的运输。五指山猪生长激素受体基因突变都发生在生长激素受体的胞内结构域,这些突变可能改变生长激素受体的空间构像,从而对生长激素受体的胞内信号转导产生一定的影响,影响生长激素-生长激素受体-胰岛素样生长因子轴的信号级联,削弱生长激素的促生长作用。     

PNPLA5基因敲除对大鼠睾丸形态学及精子运动能力的影响

旨在研究PNPLA5基因对雄性大鼠繁殖性能的影响。本研究以PNPLA5敲除型雄性大鼠(KO)为试验组,野生型大鼠(WT)为对照组,分别饲喂普通饲料,并采集大鼠附睾精子及睾丸组织。利用繁殖试验检测配种后雌鼠的妊娠率及平均产仔数,精子运动性能分析检测精子运动能力,Western blot检测精子中线粒体功能相关细胞色素C(cytochrome C,Cytc)与细胞色素C氧化酶亚基IV(cytochrome c oxidase subunit IV,COX IV)的表达水平,HE染色检测睾丸组织形态。结果表明:与野生型雄性大鼠相比,PNPLA5敲除型雄鼠与野生型雌鼠配种后,雌鼠的妊娠率极显著下降(P<0.01);精子的曲线运动速度显著降低(P<0.05)及渐进运动精子的百分率极显著降低(P<0.01);PNPLA5敲除型大鼠精子中细胞色素C表达量下调,细胞色素C氧化酶亚基IV表达量上调,但差异均不显著(P>0.05);PNPLA5基因缺失引起大鼠睾丸组织结构疏松,曲细精管中各阶段生精细胞排列紊乱,上皮细胞脱落至管腔。综上表明,本研究发现PNPLA5基因敲除能够引起雄性大鼠繁殖能力降低,为家畜繁殖研究提供重要的参考依据。