草坪虫害生物防治的研究进展

草坪害虫对草坪的建植危害很大,特别是地下害虫的危害可造成草坪的大面积死亡.鉴于化学防治存在很多不足之处,因而生物防治技术被日益提上议事日程.为此概述了草坪主要害虫种类及其危害,以及近年来利用微生物、植物等杀虫剂对草坪害虫的防治,重点讨论了草坪抗虫基因工程所取得的研究进展.     

双抗夹心ELISA方法检测转cry8Ca基因烟草的杀虫蛋白

为了检测转cry8Ca基因烟草的杀虫蛋白,建立了双抗夹心ELISA检测体系。确定多克隆抗体浓度为1:3200,酶标结合物浓度为1:400,pH 9.6碳酸缓冲液提取,pH7.4磷酸缓冲液包被,0.5%明胶-PBST封闭,TMB底物作用15min为最佳双抗夹心ELISA检测条件。采用这一检测体系,对转cry8Ca基因烟草植株进行检测,S12株系中的植株Cry8C蛋白含量最高,每克鲜重含有12.683-14.461ug,占总蛋白量的0.052%-0.062%。     

我国不同森林立地带土壤中苏云金芽孢杆菌cry基因资源研究

利用PCR－RFLP鉴定体系和SDS－PAGE表达蛋白的分析方法，分析了来自我国不同森林立地带（寒温带，中温带，暖温带，北亚热带，中亚热带，南亚热带，高原亚热带，热带）自然保护区森林土壤中分离的72株苏云金芽孢杆菌的cry 1，cry 2，cry 3，cry 4，cry 5，cry 8，cry 9，cry 10，cry 11，cry 1I杀虫晶体蛋白基因类型，表达蛋白和杀虫活性的生物测定。研究表明：同时含有cry 1，cry 2，cry 1I3类 有21株菌，6株菌含有cry 1，cry 2类基因，4株菌含有cry 1和cry 1I基因，只含有cry 1基因的1株，cry 2基因的4株，36株菌不含所鉴定的10类基因。同时证明：绝大多数含有cry1基因的菌株表达了130kD蛋白，含有cry2基因的菌株表达了60kD的蛋白。对不同农，林害虫棉铃虫，杨扇舟蛾，舞毒蛾，马尾松毛虫，黄粉甲，榆兰叶甲，落叶松叶蜂等幼虫的杀虫活性进行了生物测定。进一步证明了苏云金芽孢杆菌cry基因，表达蛋白及杀虫活性三者的相关性。为生产和科研提供了生物治虫，抗虫育种的苏云金芽孢杆菌cry基因资源。     

苏云金芽胞杆菌谷氨酰胺合成酶基因glnA的转录调控和过表达

氮代谢对细菌生存至关重要，谷氨酰胺和谷氨酸盐在细菌氮代谢中发挥重要作用。本文对苏云金芽胞杆菌谷氨酰胺合成酶基因glnA的转录调控及过表达进行了研究。通过构建glnR基因的缺失突变株及glnA基因启动子融合lacZ基因的表达载体，测定突变株中glnA启动子活性，发现在胞外营养充足的情况下转录因子GlnR负调控glnA基因。同时在glnR基因苏云金芽胞杆菌缺失突变株中过表达glnA基因。发现与野生型相比，过表达菌株杀虫活性得到提高。     

四株对小地老虎有活性的苏云金芽胞杆菌的毒力评价

本文对4株苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis（Bt）的杀虫基因类型、杀虫蛋白表达类型、蛋白表达量以及杀虫活性进行了初步的评价分析。菌株PS9-D12和PS9-C12的基因类型与蛋白表达类型丰富,且其杀虫蛋白表达量是对照菌株HD-1的1.7倍。在相同培养条件下,制备菌株胞晶混合冻干粉对小地老虎Agrotis ypsilon的生测结果显示,菌株HD-1、PS9-D12、PS9-C12、PS9-D11和PS9-H9的LC50分别为0.71、0.19、0.14、0.24和1.16 mg·g^-1,菌株PS9-D12和PS9-C12的杀虫活性显著高于菌株HD-1（P〈0.05）;此4株菌株对小菜蛾Plutella xylostella幼虫的校正死亡率均大于78%,它们对甜菜夜蛾Spodoptera exigua幼虫的活性均高于菌株HD-1;而对大猿叶甲Colaphellus bowringi幼虫均无活性。可见菌株PS9-D12和PS9-C12比商业化生产的HD-1有更好的杀虫活性,可作为Bt杀虫剂的候选材料。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

γ-氨基丁酸代谢旁路阻断对苏云金芽胞杆菌芽胞形成和晶体蛋白产量的影响

γ-氨基丁酸旁路(GABA shunt)普遍存在于原核和真核生物体中,对于动物、植物和微生物具有不同的生理功能.苏云金芽胞杆菌gab基因簇中gabT和gabD基因所编码的γ-氨基丁酸转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶参与GABA shunt.在前期研究获得的苏云金芽胞杆菌HD-73菌株gabT、gabR(gab基因簇中的调控基因)和gabD基因缺失突变菌株的基础上,从菌株生长、芽胞产量和晶体蛋白产量等方面研究GABA shunt阻断对Bt芽胞和晶体形成的影响.结果表明,GABA shunt阻断对芽胞产量有一定影响,但对Bt生长和晶体蛋白产量无明显影响     

转cry2Ab4和vip3Aa11基因烟草对小地老虎杀虫效果研究

小地老虎严重危害农业生产,通过转基因技术提高作物对小地老虎的杀虫效果是一条切实可行的途径。cry2Ab4和vip3Aa11是从苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis,Bt）中克隆到的两个杀虫基因。分别构建了pCS2Ab和pCSvip3A两种植物表达载体,利用农杆菌介导法转化烟草（Nicotiana tabacum L.）NC89,并得到32株和35株阳性转基因植株。通过对其进行RT-PCR分析、Western杂交分子检测证实两种外源基因在烟草植株中可以正常表达。人工饲喂初龄小地老虎幼虫,对两种转基因植株进行生物活性检测,结果显示饲喂转基因叶片的小地老虎幼虫死亡率在82%以上,抗虫能力比对照显著提高,转vip3A植株抗虫效果优于转cry2Ab植株。     

苏云金芽孢杆菌cry基因芯片检测方法的研究

 建立了一种不经PCR扩增而直接应用寡核苷酸芯片从苏云金芽孢杆菌总DNA中检测cry基因的方法。对探针长度、浓度、总DNA含量、标记方法以及灵敏度等条件进行了研究。结果表明,用高浓度Klenow酶随机标记高浓度的总DNA与寡核苷酸探针(40～50mer、40μmol·L-1)杂交可用于检测Bt菌株中含有的cry基因;不同长度探针之间对杂交信号的影响存在显著性差异(P<0.01),而不同浓度的探针之间没有显著性差异。此方法的其它条件为杂交温度42℃、时间3h;检测的样品总DNA的灵敏度约为2.5μg;标记产物杂     

Bt分子生物学研究进展

简要描述了苏云金芽孢杆菌近年来分子生物学研究的进展情况，重点阐述了cry基因鉴定方法。另外分析了目前转基因植物与基因工程菌的研究，并对今后的研究进行了展望。