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1.
实时荧光定量PCR技术研究进展及应用   总被引:12,自引:1,他引:11  
实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术.它利用荧光实时检测PCR反应,具有灵敏度高、特异性强、节约时间等优点.文章就常用的4种方法,即DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探针的原理和特点进行介绍,同时综述了荧光定量PCR技术在实践中的应用.  相似文献
2.
鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立   总被引:12,自引:1,他引:11       下载免费PDF全文
根据GenBank上鸡β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法(real-time PCR)。以常规PCR产物为标准品,建立了标准曲线,并进行了熔解曲线分析。结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%;熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰,其Tm为88±0℃,检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。  相似文献
3.
基于TaqMan探针的Real-time PCR定量检测空肠弯曲杆菌   总被引:8,自引:0,他引:8  
空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。  相似文献
4.
实时定量PCR试验设计原则及应用   总被引:8,自引:0,他引:8  
笔者对实时定量PCR试验设计原则及其在医学、分子生物学、食品检测的应用上进行了概述.  相似文献
5.
多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌方法的建立及应用   总被引:7,自引:1,他引:6  
建立了一种快速检测Ⅱ型猪链球菌(Streptococcus suis)的多重荧光PCR(multiplex real-time polymerase chain reaction)方法。首先,从GenBank中获得Ⅱ型猪链球菌荚膜抗原编码基因簇中的cps2I和溶菌素释放蛋白基因mrp,用PrimerExpress2.0设计引物和Taqman荧光探针,在ABl7500荧光PCR仪上进行荧光PCR检测。荧光曲线表明该多重荧光PCR可以特异性地检测Ⅱ型猪链球菌,而参考猪链球菌、大肠杆菌等细菌和空白对照均为阴性;检测方法灵敏度达10个细菌的最小检测量,整个过程仅需60min;稳定性试验表明,2次检测所得的ct值之间无统计学差异(P〉0.05)。本试验建立的多重荧光PCR检测Ⅱ型猪链球菌的方法快速、特异性强,灵敏度高,稳定性好,适合于大批量样品的检验,可广泛用于出入境检疫和动物防疫监督部门的疫情监测。  相似文献
6.
牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:4,自引:1,他引:3  
根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测.结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应.本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测.  相似文献
7.
为探讨脑心肌炎病毒(EMCV)感染后IL-6、iNOS基因的表达水平,从分子水平深入研究EMCV的致病机制,分别针对小鼠IL-6、iNOS及管家基因β-actin 的基因序列设计特异性引物和探针,构建含有各自引物扩增序列的重组质粒作为阳性标准品,建立了检测IL-6、iNOS和β-actin的TaqMan real-time PCR检测方法。该方法线性关系好,IL-6、iNOS和β-actin标准曲线的相关系数均达到0.998;敏感性高,初始模板的检出下限均达到1×101拷贝/μL;特异性强,只有以总RNA反转录成的cDNA为模板,并加入特异性引物和探针的反应才检测到荧光信号;重复性好,组内与组间的变异系数均小于2%。应用所建立的检测方法,对猪源EMCV GXLC株感染小鼠的脑、心脏中IL-6、iNOS mRNA的表达水平进行了检测。结果表明,本研究建立的TaqMan real-time PCR检测方法灵敏度高、特异性强、重复性好,可以用于小鼠IL-6、iNOS基因的检测及定量分析。  相似文献
8.
To establish a real-time polymerase chain reaction with SYBR® Green for detection and quantification of porcine parvovirus (PPV) in porcine tissues, two primers specific for the non-structural protein 1 gene were designed. The detection limit of this assay was 3–23 gene copies/reaction, equivalent to 0.001 TCID50/ml. The assay was linear over a 106 dilution range of template concentrations. Other porcine pathogens involved in reproductive disorders (porcine circovirus 2, porcine reproductive and respiratory virus, pseudorabies virus, classical swine fever virus) were negative by this assay. This assay could detect PPV titres at least 105 smaller than the hemagglutination assay. To better understand the pathogenesis of PPV, the levels of viral DNA in various tissues of artificially challenged sows and their fetuses were quantified with this method. The virus was found mainly in the heart, lung, spleen, kidney, and endometrium of sows, and mainly in the heart, spleen, lung, and testis of fetuses. This study provides a new tool for the study of PPV infection and distribution in sows and their fetuses.  相似文献
9.
瘤胃微生物定量方法的研究进展   总被引:3,自引:0,他引:3       下载免费PDF全文
当前人们对瘤胃中微生物的认识只有10%~20%,不断改进研究技术和手段,才能大大推动瘤胃微生态领域的研究。作者阐述了瘤胃微生物传统定量方法(滚管计数法和最大或然数法)和分子生物学定量方法,如探针杂交技术、荧光原位杂交、DGGE、定量PCR和流式细胞计量术(flow cytometry )等的应用状况及其各自的优缺点。  相似文献
10.
胸膜肺炎放线杆菌的实时荧光PCR检测   总被引:2,自引:0,他引:2  
猪传染性胸膜肺炎是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的危害养猪业的五大疾病之一。至目前为止App共报道有2个生物型15个血清型。所有型都可能致病,但有显著差异。使用血清学方法监测猪传染性胸膜肺炎有其局限。一些猪细菌分离培养阳性,但血清反应仍为阴性,对这些猪群只能使用病原分离进行确诊。亚临床感染及处于潜伏期的动物,  相似文献
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