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1.
牛传染性鼻气管炎病毒gE基因的截短克隆与表达   总被引:6,自引:0,他引:6  
以牛传染性鼻气管炎病毒Baaha Nu/67株的DNA作为模板,用PCR扩增gE基N并克隆至pGEM-T Easy裁体,再以此质粒作为模板将gE基因分成6个片段,分别插入原核表达载体pET32a并在大肠杆菌中进行了表达。蛋白电泳结果表明6个片段中有2个片段以可溶形式表达,1个片段以包涵体形式表达,另外3个片段没有表达。采用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下对两个可溶性片段进行了纯化。经免疫印迹试验,间接ELISA和交叉试验证明,两个纯化的重组蛋白均与牛传染性鼻气管炎阳性血清样品发生反应,而与牛传染性鼻气管炎阴性血清无任何反应,显示其具有良好的抗原性和特异性,可用于牛传染性鼻气管炎gE-ELISA诊断方法的建立。  相似文献
2.
伪狂犬病病毒Fa株gE基因的克隆与序列的比较分析   总被引:4,自引:0,他引:4  
根据已发表的伪狂犬病病毒(PRV)的基因序列,设计合成一对引物PCL1和PCL2,以PRV Fa株的DNA为模板成功地扩增得到预期的长约1.7kb的特异片段,经本科切鉴定,初步确定为gE基因。将扩增产物经Kpn Ⅰ、EcoRⅠ消化形成粘末端克隆到pUC18质粒,得到了明显大于载体的重组质粒PpgE。重组质粒PpgE经本科切鉴定为含有PRV的gE基因,测序PpgE得到完整的gE基因片段,并与4株不同来源的毒株进行了比较分析。5毒株的gE同源性比较分析发现毒株间同源性最低也高达97%,这体现了gE基因的保守性。分析还表明Fa与TNL同源。同时99%的高同源性也显示Fa、Ea、SH可能是同一毒株。gE序列在1040-1410碱基的高同源性区域作为PRV的PCR检测或作为PRV的PCR检测或作为核酸探针是非常重要的。  相似文献
3.
从广西玉林博白某猪场采集的发病仔猪大脑和内脏病料中分离到一株病毒。病毒接种家兔后引起典型的奇痒、神经症状,接种PK-15细胞出现典型的细胞病变,病毒效价(TCID50)为10-7.22/0.1 ml。设计扩增PRV gE胞外区基因的引物,能扩增出约947 bp的特异性片段,将扩增出的目的片段进行克隆、测序,并与国内外不同PRV毒株进行分析比较,发现该毒株与国内MinA株、Ea株、SH株、LA株、GXB株、GXW株核苷酸同源性在98.7%~99.4%之间,氨基酸同源性在98.1%~99.1%之间,上述结果证实该分离毒株为伪狂犬病病毒,命名为GXBB株。GXBB株与国内流行毒株同源性很高,说明目前广西PRV流行株变异不大。这为下一步广西伪狂犬病的预防和净化工作提供科学的理论基础。  相似文献
4.
猪伪狂犬病病毒XIN-W株gD和gE基因的克隆及序列分析   总被引:3,自引:0,他引:3  
根据已发表的PRVgD、gE基因序列 ,设计合成了两对引物 ,对猪伪狂犬病病毒XIN W株相关的毒力基因gD、gE序列进行测定和分析。经PCR扩增分别得到了全长为 12 0 9bp,1 743bp的gD、gE全基因序列 ,将它们克隆到pGEM T Easy载体中 ,并转化JM1 0 9,挑取阳性菌落的质粒进行PCR、酶切、测序鉴定 ,与其他参考毒株的gD、gE基因进行比较。结果表明 ,XIN W株与其它毒株相比 ,gD、gE基因核苷酸序列的同源性分别为 97.9%~99.3 % ,98.0 %~ 98.7% ;氨基酸序列的同源性分别为 97.0 %~ 99.3 % ,97.1 %~ 98.1 %。不同的PRV毒株间gD、gE基因在核苷酸水平和氨基酸水平高度保守。遗传进化树显示 ,XIN W株和国内其它毒株起源相同 ,属同一进化分支  相似文献
5.
伪狂犬病病毒gE基因的原核表达及间接ELISA方法的建立   总被引:3,自引:1,他引:2  
以质粒pBV222/gE为模板,经PCR扩增出750 bp的伪狂犬病病毒(PRV)gE基因片段,克隆入pET-41b质粒中并转化大肠埃希菌TG1。经PCR、酶切鉴定,筛选出阳性重组质粒pET41b/gE后,转化表达菌Balgold,IPTG诱导,目的蛋白经镍柱亲和层析纯化,SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot分析检测。以纯化后的目的蛋白作包被原,建立间接gE-ELISA检测方法。结果表明,目的基因在30℃,0.025mmol/LIPTG诱导条件下,可在Balgold中高效表达,目的蛋白大部分以可溶性形式存在,并能被PRV阳性血清所识别,方阵滴定法确定了间接ELISA方法的抗血清最佳稀释度(800倍)和包被抗原的最佳工作浓度(1 mg/L)。  相似文献
6.
伪狂犬病病毒广西B、W株gE基因的扩增、克隆及序列分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
在已鉴定了的伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)11种糖蛋白中,gE是其中十分重要的一种非必需糖蛋白,是伪狂犬病病毒重要的毒力基因,它在介导感染细胞的融合,病毒在细胞间的扩散,病毒粒子的释放等方面均起着十分重要的作用,尤其是在影响伪狂犬病病毒神经嗜性和毒力方面的作用。利用PRV gE基因缺失疫苗,结合血清学方法可以区分疫苗接种猪和野毒感染猪。  相似文献
7.
伪狂犬病病毒上海株gE和gI基因的克隆及序列分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
参考Genebank发表的伪犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)的gI和gE基因序列,自行设计并合成了两对引物,对PRV上海株(PRV-SH)进行PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,均呈现一条约960bp和1740bp的条带,将其克隆入pGEM-T-easy载体中,进行了序旬测定,将PRV-SH株的gI基因与Rice株gI基因比较发现,核苷酸的同源性为94.7%,氨基酸的同源性为91.3%,证实为gI基因,将PRV-SH gE基因序列与Ea株、Ruce株gE基因序列进行比较,结果显示,该序列与PRV Ea株、Rice株gE基因的同源性分别为98.5%、97.5%;的氨基酸序列与Ea株,Rice株和I型单纯疱疹病毒(HSV-1)17株gE的同源性分别为97.2%、94.8%和15.6%。  相似文献
8.
根据伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的序列与身份种真核表达载体pPICZaA、pAcGP67A序列与特性分别设计了两对PCR引物。通过PCR方法扩增到了两端具有不同酶切位点的gE基因表位抗原编码片段。将这2个片段分别克隆到pPICZaA与pAcGP67A载体,转化大肠杆菌TOP10菌档及XL1-Blue菌株,获得了含伪狂犬病病毒闽A株gE基因表位抗原编码区的重组质粒pICZaA-FS与pAcGP67A-FS。序测定结果显示两个重组质粒中插入片段的大小与方向均正确。  相似文献
9.
摘要:以纯化的抗人红细胞单链抗体(ScFv)—猪伪狂犬病病毒(PRV)gE蛋白双功能融合蛋白为抗原,建立了检测猪伪狂犬病毒gE抗体的红细胞凝集试验。利用方阵滴定试验筛选出最佳抗原工作浓度为55 μg/mL,血清最佳稀释度为1∶20,作用时间15 min,与猪瘟(CSF)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)、猪乙型脑炎(JE)、猪布氏杆菌病(Brucellosis)阳性血清和PRV gE缺失疫苗接种的猪免疫血清均不出现红细胞凝集现象,与PRV标准阳性血清反应出现肉眼可见的凝集圈。与美国进口的PRV抗体检测gE- ELISA诊断试剂盒检测结果比较,50份猪血清的阴、阳性检出符合率均为100%。红细胞凝集试验检测方法具有操作简便、敏感性和特异性较高的特点,可用于PRV野毒感染的快速筛查。  相似文献
10.
猪伪狂犬病病毒PCR检测方法的建立与应用   总被引:2,自引:1,他引:1  
参考GenBank中收录的猪伪狂犬病病毒gE基因序列,应用Primer5.0软件设计了一对引物,扩增目的片段为632 bp.进行PCR检测方法的特异性、敏感性、重复性及符合性试验,建立了PRV的PCR检测方法.应用该方法对临床疑似发病样品进行了检测,PRV检出率为14.6%.表明该方法具有快速、特异、敏感、重复性好等优点,可用于PRV的临床发病诊断及流行病学监测等.  相似文献
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