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1.
猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:6,自引:4,他引:2  
通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。  相似文献
2.
猪传染性胃肠炎病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立   总被引:4,自引:0,他引:4  
根据猪传染性胃肠炎病毒和猪肌动蛋白的基因序列设计合成了引物和探针,通过对荧光定量RT-PCR反应条件的优化,建立了TaqMan荧光定量RT-PCR检测TGEV的方法。同时对37份现地病料进行检测并与常规RT-PCR方法、TGEV抗原快速检测试剂盒比较。结果,该方法的检测敏感性达到15.3拷贝/μL,且具有很好的特异性和重复性,而常规RT-PCR方法只能检测到1.53×103拷贝/μL。对37份现地病料的检测结果也表明该法(检出17份)比常规RT-PCR方法(检出12份)和TGEV抗原快速检测试剂盒(免疫层析法,检出10份)的敏感性高。  相似文献
3.
猪瘟病毒荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:3,自引:1,他引:2  
通过RT-PCR方法克隆了猪瘟病毒(CSFV) 5′端非编码区(UTR)的一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.同时根据GenBank中的靶序列设计了用于FQ-PCR的一对引物和一条TaqMan探针.通过条件优化,以定量的10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了CSFV检测的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为 109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为19.73、22.95和26.24;变异系数分别为0.61%、1.77%和1.18%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.  相似文献
4.
H3亚型猪流感病毒荧光定量PCR检测方法的建立   总被引:3,自引:1,他引:2  
通过RT-PCR方法克隆了H3亚型猪流感病毒HA基因一段靶序列,构建重组质粒作为标准阳性模板.根据GenBank中的H3亚型猪流感病毒HA基因保守序列设计了用于FQ-PCR的1对引物和1条TaqMan探针.通过条件优化,以10倍系列稀释的质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,并制作标准曲线,建立了检测H3亚型猪流感的荧光定量PCR方法.结果表明,该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×109、1.0×108、1.0×107拷贝/μL的标准品的最终实际测得值(Ct)分别为13.68,18.21和20.57;变异系数分别为0.31%、0.17%和0.12%,均小于5%,说明此方法具有良好的准确性和重现性.对阳性组织病料的检测表明,该方法的检测灵敏度高出常规PCR,与套式PCR具有相近的灵敏度.  相似文献
5.
实时定量RT-PCR检测马动脉炎病毒   总被引:2,自引:0,他引:2  
选取马动脉炎病毒(EAV)基因组中高度保守的开放阅读框7(ORF7)序列,设计了特异性引物和TaqMan探针,利用一步法的实时定量RT-PCR来定量检测EAV。使用含有选定检测序列的克隆标准品做标准曲线,证明该方法可以检测出含有5(4.77)个RNA分子,即可从组织培养液(TCF)中检出一般含有5PFU/μL病毒拷贝。对猪生殖呼吸道综合征病毒、马疱疹病毒无交叉反应,特异性好。用疫苗用种毒(Bucyrus标准株)肌肉注射于马驹后,定量RT-PCR比病毒分离试验更能灵敏地检出呼吸道排出的病毒。对456份临床鼻腔分泌物样品检测,定量RT—PCR检出6份阳性,而病毒分离只检出2份阳性。一步法实时定量RT—PCR检测样品中的EAV,在快捷、准确、方便和高通量方面优于细胞培养病毒分离的检测方法,可以作为检测马病毒性动脉炎(EVA)病毒的快速方法。  相似文献
6.
实时荧光定量检测技术及应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
随着现代医学和分子生物学的飞速发展,近年来在病原体的鉴别诊断方面,不断研究和开发了一些先进的检验新技术,TaqMan荧光探针脱颖而出。这项新技术日臻成熟并开始大量应用于临床实践中。它实时、准确、定量和高度重现性的特点优于其它核酸扩增技术,在医学检验领域中颇受关注,在兽医诊断应用中也开始被采用。文章就这一新的检测技术的原理、特点、应用和研究进展进行综述并与常规PCR检测技术进行对比。  相似文献
7.
猪流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立   总被引:2,自引:1,他引:1       下载免费PDF全文
本研究选取猪流感病毒(swine influenza virus,SIV)的NP基因序列设计引物和探针,建立了检测SIV的TaqMan实时荧光定量PCR方法。以梯度稀释的含有SIV目的扩增片段的质粒作为标准品,进行定量PCR反应以确定检测灵敏度。2.0×108至2.0×102拷贝/μL 7个数量级的范围内定量PCR有"S"型扩增曲线,检测灵敏度为20个拷贝/μL。根据病毒拷贝数与Ct值的关系绘制了标准曲线。该方法具有特异性,对猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、口蹄疫病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸都没有扩增反应。本研究建立的实时定量PCR方法,灵敏度高、特异性好,可以进行定量分析,在猪流感的快速检测上具有重要意义。  相似文献
8.
猪瘟病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立   总被引:2,自引:1,他引:1  
本研究在CSFV 5′端非编码区设计一对引物和一条特异性TaqMan探针,以构建的重组质粒为标准品,建立了一种检测CSFV的荧光定量PCR方法(FQ-PCR),对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验。结果显示,可特异地检测CSFV,该方法在101~107拷贝/μL范围内具有良好的线性关系,灵敏度可达10拷贝/μL,重复检测的变异系数均小于5%。临床样品检测表明建立的方法与套式PCR灵敏度相近。结果表明该方法重复性良好,可用于临床诊断。  相似文献
9.
根据GenBank中公布的猪流行性腹泻病毒Ⅳ基因序列,设计了一对特异性引物和探针,扩增长度为186bp的片段。以克隆Ⅳ基因的质粒作为阳性标准品,建立了一种快速检测猪流行腹泻病毒含量的TaqMan荧光定量PCR方法。该方法在10^9-10^1copies/μL范围内具有良好的线性关系,可检测到初始模板中10copies/μL的质粒DNA,以猪圆环病毒、猪乙脑病毒、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒为模板时,均检测不到荧光信号,而重复性实验中其变异系数均小于2%,表明此方法具有很好的特异性和重复性。应用此方法对采集的60份,陆床样品进行检测,其阳性检出率为92%,而用常规RT-PCR方法进行检测,阳性检出率仅为80%。表明荧光定量RT-PCR方法的敏感性明显高于常规PcR检测方法。  相似文献
10.
蜜蜂球囊菌荧光PCR快速检测方法的建立及应用   总被引:2,自引:0,他引:2  
以蜜蜂球囊菌ITS1、ITS2和5.8 S rDNA保守序列(U68313)为参考,设计一对特异性引物和一条TaqMan探针,建立了一种快速检测蜜蜂球囊菌的荧光PCR方法。该方法灵敏度达1 ng/μL的阳性DNA比常规PCR高10倍。检测的特异性高,与蜜蜂幼虫芽胞杆菌、蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂败血杆菌无交叉反应,同时可避免常规PCR因电泳造成的污染。应用该方法对蜜蜂及蜂制品的实际样品和模拟样品进行检测,结果显示所建立的荧光PCR检测方法在4 h内即可报告结果,与传统病原菌分离培养、常规PCR相比较,该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可以用于蜜蜂及其制品中蜜蜂球囊菌的快速检测和进出境检疫。  相似文献
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