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1.
实时荧光定量PCR技术研究进展及应用   总被引:12,自引:1,他引:11  
实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Real-time PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术.它利用荧光实时检测PCR反应,具有灵敏度高、特异性强、节约时间等优点.文章就常用的4种方法,即DNA结合染色、水解探针、分子信标和杂交探针的原理和特点进行介绍,同时综述了荧光定量PCR技术在实践中的应用.  相似文献
2.
鸡β-actin基因实时荧光定量PCR方法的建立   总被引:12,自引:1,他引:11       下载免费PDF全文
根据GenBank上鸡β-actin基因的序列,在保守区域设计并合成一对引物,采用SYBR Green I染料建立了荧光定量PCR法(real-time PCR)。以常规PCR产物为标准品,建立了标准曲线,并进行了熔解曲线分析。结果表明,标准曲线Ct值检测范围为12~31,扩增效率为95.1%;熔解曲线分析结果显示产物特异的单个峰,其Tm为88±0℃,检测周期从RNA提取到荧光定量PCR结束只需4 h。本试验建立的鸡β-actin基因实时荧光定量PCR法扩增效率高、检测范围广、检测周期短,为β-actin基因作为内参基因进行鸡功能基因与病原基因表达的定量分析奠定了基础。  相似文献
3.
羊驼酪氨酸酶基因家族在不同毛色个体中的基因表达水平   总被引:7,自引:3,他引:4  
黑色素对动物毛色的形成起重要作用,酪氨酸酶基因家族成员参与了黑色素的合成。为了探索羊驼酪氨酸酶基因家族的基因表达与其毛色之间的相关性,本研究利用实时荧光定量PCR技术分析了不同毛色羊驼酪氨酸酶基因家族成员TYR、TRP1和TRP2的相对基因表达量。研究结果显示:棕色羊驼中的TYR、TRP1和TRP2的mRNA相对表达量经内参基因校正后分别是白色羊驼中的13.669倍、3.417倍和8.593倍。结论表明棕色羊驼中酪氨酸酶基因家族3种成员的基因表达水平均高于白色羊驼,揭示了羊驼TYR基因家族成员的基因表达量与其毛色表型具有相关性。  相似文献
4.
荧光定量PCR法检测饲料中的牛、羊成分   总被引:6,自引:0,他引:6  
疯牛病是一种严重威胁畜牧业发展和人类生命安全的传染病,因此对于我们国家而言,急需建立一套严格,规范的检验标准,防止疫区的牛,羊肉骨粉通过直接或间接贸易进口,本文运用荧光定量PCR法,针对牛,羊两种不同动物的特异性基因序列设计带有不同荧光标记的特异性探针,对整个PCR过程采用实时监控,最终通过不同的荧光信息来鉴定饲料中的牛,羊成分。本方法能有效解决普通PCR的样品污染问题,具有特异性强,灵敏度高,重复性好等特点。  相似文献
5.
用鸭瘟病毒(DPV)Cha株弱毒苗皮下注射免疫20日龄樱桃谷鸭,应用TaqMan-MGB探针实时荧光定量PCR(FQ-PCR)对免疫后10、30、609、0 min及12、24 h和6、9、12、21、366、0 d鸭的心、肝、脾、肺、肾、脑、胸腺、法氏囊、哈德氏腺、回盲处、血液、气管、气管分泌液、食管及其分泌液、十二指肠、空肠、回肠、肓肠、直肠及各肠段分泌液中DPV-DNA的拷贝数(以对数值表示)进行了检测。结果显示,免疫后10 min即可在胸腺和血液中检测到DPV-DNA;60 min肾脏中DPV-DNA拷贝数最高(9.349);脾(9.932)、脑(9.791)、胸腺(9.736)、法氏囊(9.598)及哈德氏腺(8.135)中DPV-DNA拷贝数于90 min分别达到最高;12 h后所有受检样品中都能检测到DPV-DNA,其中心脏中DPV-DNA拷贝数最高(9.818);肠道中DPV-DNA拷贝数在免疫后6~12 d明显高于其他组织,其中盲肠是DPV-DNA拷贝数(10.591)最高的受检样品,直肠分泌液中DPV-DNA最早于90 min检测到。研究表明,免疫鸭于免疫早期在包括主要免疫器官在内的各实质...  相似文献
6.
猪流感病毒M基因实时荧光定量PCR诊断方法的建立   总被引:6,自引:1,他引:5  
根据猪流感病毒(SIV)M基因的保守序列,设计并合成一对特异性引物和Taq Man MGB探针,建立了SIV M基因实时荧光定量PCR检测方法.使用含有M基因的重组质粒pMD-M作为标准品绘制标准曲线.其相关系数为0.999,检测结果表明:该方法的敏感性可达到1个EID50,组间与组内重复试验变异系数分别为0.21%和0.65%,除SIV外,其他5种猪病病毒检测均为阴性,样品检测与病毒滴定及病毒分离结果的符合率均达到100%,该方法特异性强、重复性好,有望成为SIV的一种特异、敏感、快速的定量检测方法.  相似文献
7.
实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用   总被引:6,自引:1,他引:5       下载免费PDF全文
实时荧光定量PCR技术是一种利用不同的荧光检测方法来定量核酸的技术,具有高度的灵敏性、特异性和精确性。该技术根据荧光作用方式分为:SYBR荧光染料法、TaqMan技术、分子信标和复合探针等类型,依据其各自优缺点可将各技术方法分别应用于畜牧兽医领域不同方面的科研工作中,以期得到最优的定量检测效率。  相似文献
8.
实时荧光定量 PCR技术原理与应用   总被引:6,自引:1,他引:5       下载免费PDF全文
摘要:实时荧光定量PCR(real- time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, FQ- PCR)是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术,它具有特异性强、PCR污染少、自动化程度高等特点。作者就实时荧光定量PCR技术的主要原理及目前在分子生物学领域,病原体和肿瘤等方面的检测和诊断应用进行了概述。  相似文献
9.
对金黄地鼠P rP基因序列进行分析,选择其高度保守区域设计引物,对金黄地鼠各组织提取mRNA,经RT-PCR扩增,产物纯化后与pGEM-T-easy连接,转化大肠杆菌DH5α,筛选后得到重组标准品质粒,对重组标准品质粒进行酶切、PCR和测序鉴定,表明P rP基因保守区段已经成功克隆。将107~102拷贝/反应的重组标准品质粒进行荧光定量PCR,10次重复C t值平均分别为17.50±0.5、21.38±0.2、25.29±0.7、29.12±0.7、31.34±0.4、33.89±0.1,系统自动分析软件显示C t值与标准品浓度的对数之间存在良好的线性关系,回归系数为0.998。对动力学曲线分析表明,在该反应体系和反应条件下,该标准曲线的灵敏度为102拷贝/反应。荧光PCR P rP基因表达检测标准品质粒和标准曲线的建立,为检测P rP基因的组织特异性表达和动物传染性海绵状脑病发生的分子机理奠定了基础。  相似文献
10.
以检测水牛成纤维细胞中组蛋白乙酰转移酶(HAT1)和脱乙酰化酶(HDAC1)转录活性为例,对SYBRGreen实时荧光定量PCR技术平台的建立进行了探讨.结果显示,适宜的引物,高质量RNA反转录得到的cDNA以及合适的PCR体系为SYBR Green实时荧光定量PCR能否成功的关键因素.本试验中3对引物的灵敏度高,其反应性能完全满足SYBR Green实时荧光定量PCR的要求.2个目的基因HAT1、HDAC1的扩增效率与参照基因H2A接近,试验结果可用2-△△Ct计算法进行分析.当cDNA模板量为0.5 μL(相当于总RNA 50 ng),引物为1 μmol/L时,SYBR Green实时荧光定量PCR能高效获得特异性强的目的产物.  相似文献
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