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为了表达牛环形泰勒虫（Theileria annulata）截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点（pI）为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37 ℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

牛环形泰勒虫HSP70基因的克隆表达、特性分析及互作蛋白网络构建

为了表达牛环形泰勒虫(Theileria annulata)截短HSP70基因编码蛋白并研究该蛋白的结构与功能特性,本研究扩增牛环形泰勒虫HSP70目的基因并构建重组质粒pMD18-T-HSP70,选取其他种的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树;利用生物信息学方法分析HSP70基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白的二级结构和三级结构;对重组蛋白HSP70进行蛋白互作网络分析;构建原核表达载体pET28a-HSP70,筛选诱导表达条件,镍柱纯化重组蛋白及检测反应原性。结果显示,牛环形泰勒虫HSP70蛋白序列与小泰勒虫的序列同源性较高,蛋白分子质量为42 ku,理论等电点(pI)为5.61,属于酸性亲水性蛋白,无跨膜区及信号肽;蛋白功能预测结果显示,HSP70包含32个可能的磷酸化位点,亚细胞定位分析显示该蛋白主要分布于细胞质。蛋白质二级结构中α-螺旋、β-转角、无规则卷曲、延伸链分别占39.18%、8.51%、30.41%和21.91%。蛋白互作网络构建结果显示,与HSP70相互作用的蛋白主要为HSP90家族成员,另外还有伴侣蛋白GrpE同系物,预示着HSP70可能在细胞内与HSP90形成复合体发挥作用。本试验成功构建原核表达载体,获得了大小约为48 ku的融合蛋白,以0.6 mmol/L IPTG于37℃诱导5 h,蛋白表达较好;点状印迹及Western blotting结果表明,表达产物可被自然感染的牛环形泰勒虫阳性血清识别,具有良好的反应原性。本试验结果为进一步探讨牛环形泰勒虫HSP70功能机制提供了理论依据。     

牛呼吸道合胞体病毒G蛋白抗原区原核表达及反应原性鉴定

本研究旨在获得重组牛呼吸道合胞体病毒（BRSV） G蛋白并对其进行反应原性鉴定。从NCBI上找出G基因的核苷酸序列，分析其抗原区域，利用Primer Premier 5.0软件设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增BRSV G基因片段，将目的片段连接到克隆载体pMD19-T后，对其进行双酶切鉴定和测序。将双酶切后的目的片段进行胶回收，构建重组质粒pET-32a-G，将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用Ni-IDA亲和层析法纯化经IPTG诱导表达的蛋白，并测定其浓度；通过SDS-PAGE和Western blotting方法对该蛋白进行分析与鉴定。结果显示，本试验成功克隆出大小约为567 bp的G基因，获得分子质量约为40 ku的可溶性重组蛋白，优化诱导条件后用SDS-PAGE对表达产物进行鉴定，在16℃、IPTG浓度1.2 mmol/L、诱导4 h时蛋白表达量最大；通过Western blotting检测发现，重组蛋白可与山羊源BRSV标准阳性血清发生特异性反应，说明该蛋白具有反应原性。综上，本研究成功表达并纯化了BRSV G蛋白，为建立BRSV抗体间接ELISA检测方法和BRSV亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

布鲁氏菌omp28基因的克隆、表达及反应原性分析

本研究克隆了羊种布鲁氏菌16M株、羊种布鲁氏菌M28株、犬种布鲁氏菌、绵羊附睾种布鲁氏菌、牛种布鲁氏菌A19株、猪种布鲁氏菌S2株的omp28基因并对以上不同种菌株的omp28基因序列及编码的氨基酸序列进行了比对,结果显示不同种布鲁氏菌omp28基因之间仅6个碱基不同,而且只有2个氨基酸不同,亲水性分析结果显示两处氨基酸的差异对蛋白亲水性不造成影响.将羊种布鲁氏菌16M的omp28基因亚克隆到pET32a中表达,OMP28在低温下诱导以可溶性形式高效表达.Westem-blot结果显示OMP28反应原性良好,是布鲁氏菌病诊断抗原的可能选择.     

猪链球菌Sao-M和IdeSsuis蛋白的原核表达与反应原性分析

通过原核表达系统表达猪链球菌Sao-M和Ide_(Ssuis)基因,并分析其反应原性。根据GenBank数据库发表的序列,利用分子生物学软件设计了2对特异性引物,通过PCR扩增Sao-M和Ide_(Ssuis)基因,经测序分析后,分别克隆到pET28a(+)和pMAL-c2X,构建重组表达质粒pET28a:Sao-M和p MAL-c2X:Ide_(Ssuis),然后将鉴定为阳性的重组质粒分别转入宿主菌BL21和Rosetta2中用IPTG进行诱导表达,通过免疫印迹进行鉴定。实验表明,两种重组蛋白在原核系统中获得了高效的表达,并能与相应的阳性抗血清发生特异性反应。本研究为进一步探究Sao-M和Ide_(Ssuis)蛋白生物学功能及其在猪链球菌致病机制上的作用提供了依据。