饵料种类和密度对毛蚶浮游幼虫生长的影响

通过投喂不同种类和不同浓度藻类对毛蚶浮游幼虫的生长进行了研究。结果表明在三种不同的单细胞藻类中湛江球等鞭金藻的效果最好,微绿球藻次之,而小球藻最差。在不同饵料浓度下,表明在初期投喂5×107L-1(cells/L)比较适宜,而后期以10×107L-1比较合适。     

辽东湾毛蚶繁殖季节研究

根据1982年、1983年、1984年辽东湾自然海区毛蚶浮游幼虫调查、生殖腺组织切片比较、生殖腺指数测定以及1983年毛蚶室内产卵试验,初步认为:辽东湾毛蚶繁殖季节是7月10日～8月末,水温22～27℃。产卵盛期在7月15～30日,水温24～26℃。不同年份因水温不同产卵期可相差约5d。毛蚶产卵主要集中在两次产卵高峰期内,每个高峰可持续2～3d,两次高峰期间隔15～20d。     

魁蚶食性及摄食季节变化的初步研究

根据1990年10月～1991年9月在山东烟台近海采集的魁蚶样品观察和分析,结果表明,魁蚶的食物组成比较简单,以摄食植物性饵料为主,兼食浮游动物。主要种类有硅藻门的圃筛藻、舟形藻、菱形藻、曲舟藻、沟直链藻和粗纹藻以及浮游动物中的挠足类。除冬季外,魁蚶在其他季节均摄食。摄食的种类主要取决于自然海域中硅藻类等优势饵料生物种类的季节变化。     

魁蚶精子发生的超微结构

利用透射电镜(TEM)技术观察了魁蚶精子发生过程的超微结构变化。结果表明:魁蚶精子发生经历了精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞、精子细胞和精子形成等过程,在精子形成中的主要细胞学事件包括顶体的发育、核形态变化及尾部的形成等。此过程中,前顶体颗粒聚集、融合,形成顶体囊,然后发育为圆锥形顶体;核的形态由圆形或卵圆形变为鼓形,核内染色质由团块状到颗粒状,再到高电子密度均质;线粒体聚集、融合、体积变大,迁移至核的后端,参与精子中段的形成。成熟精子由头部、中段及尾部组成,头部由顶体及核构成,中段由5个线粒体围绕远端中心粒组成,尾部为细长的鞭毛。研究亮点:魁蚶为我国重要的海产经济贝类之一,目前对其精子发生过程的超微结构未见研究报道。利用透射电镜技术观察了魁蚶精子发生过程中精子顶体的形成、核的形态建成等主要细胞学事件,探明了魁蚶精子属原生型,顶体物质的合成始于初级精母细胞时期,细胞核在精子发生过程中形态变化不大等问题,为蚶科精子发生机制的深入研究提供了参考。     

魁蚶C型凝集素基因cDNA的克隆及表达分析

通过cDNA末端快速扩增(Rapid amplification of c DNA ends,RACE)技术克隆得到魁蚶(Scapharca broughtonii)C型凝集素(C-type lectin,Sb-Lec1)基因,该基因全长为700 bp,其中,5′-UTR为29 bp,3′-UTR为167 bp,开放阅读框长度为504 bp,编码167个氨基酸,包括长度为23个氨基酸的信号肽序列、129个氨基酸的糖识别结构域(CRD)以及参与二硫键形成的6个半胱氨酸。预测蛋白分子量为19.11 k Da,理论等电点为4.74。多序列比对结果显示,Sb-Lec1基因CRD编码的氨基酸序列与长牡蛎(Crassostrea gigas)、紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)和海湾扇贝(Argopecten irradians)C型凝集素的同源性分别为38%~40%、34%~35%和38%~39%,Sb-Lec1基因编码的氨基酸序列与其他物种的凝集素基因具有相似的结构,均含有形成二硫键的4个保守半胱氨酸。系统进化分析结果显示,魁蚶先与贝类聚为一支,再与脊椎动物聚在一起,表明魁蚶Sb-Lec1基因在进化树上的位置与其传统分类所处位置一致。采用荧光定量PCR技术,检测了Sb-Lec1基因在组织中的表达情况,发现其在肝胰腺、血淋巴、鳃、外套膜、闭壳肌、斧足中均有表达,其中,肝胰腺表达量最高。同时,分析了Sb-Lec1基因在鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激下的mRNA表达量变化情况。结果显示,与对照组相比,菌刺激组Sb-Lec1基因mRNA在各检测组织中的表达量均显著上调(P0.05),随着刺激时间的延长,表达量呈先升高后降低的趋势。本研究表明,魁蚶Sb-Lec1基因在机体免疫防御方面发挥重要功能。     

基于线粒体基因组COI和12S rRNA序列的魁蚶中国群体分类学地位研究

东北亚地区不同地理种群魁蚶(Scapharca brouhtonii)的分类学地位仍存在较大争议。为探讨魁蚶中国群体的分类地位,测定了魁蚶中国群体线粒体基因组COI和12S rRNA序列,并从GenBank中下载了蚶科26种贝类的同源序列进行分析。以贻贝科的贻贝(Mytilus edulis)为外群,用邻近法和最大简约法构建了蚶科贝类的分子系统进化树,分析其分子系统进化关系和分类等级。结果显示,魁蚶中国群体的COI和12S rRNA基因的碱基组成、密码子使用率及变异位点等与魁蚶日本群体和粗饰蚶属的Anadara sativa相似,且遗传距离很小,进化树中聚为一支,亲缘关系很近,初步确定魁蚶中国群体的分类地位和魁蚶日本群体一致。本研究结果初步阐明了魁蚶中国群体的分子系统进化地位,有利于掌握魁蚶的遗传背景和资源状况,以应用于自然资源的保护和推动养殖业的发展。     

温度对魁蚶能量代谢及抗氧化酶活性的影响

采用实验生态学方法,研究了魁蚶能量代谢及抗氧化酶活性对不同温度水平(20、23、26和29°C)的响应。结果显示,魁蚶的摄食率和排粪率都随着温度的升高而降低,单因素方差分析表明,温度显著影响魁蚶摄食率,而对排粪率的影响不显著。魁蚶耗氧率和排氨率随温度的升高呈先增高后降低的趋势,均显著受温度影响。通过建立能量收支方程,发现温度影响魁蚶的能量分配,20°C魁蚶呼吸能占13.71%、排泄能占1.89%、排粪能占22.94%、生长能占61.47%,但是超过20°C,摄食能显著减少,生长余力甚至出现负值。方差分析表明,温度对魁蚶的摄食能和生长余力均具有显著影响。魁蚶外套膜、鳃和肝胰腺的抗氧化酶活性分别在实验开始后的0、4、8、12、24、48和72 h取样检测,在20～29°C,魁蚶体内的T-AOC呈先升高后降低的趋势,且29°C温度下的T-AOC均低于其他温度组。短期内的高温刺激能够促使SOD和CAT活性升高,但超过24 h其组织中的SOD和CAT活性降低,其中鳃和肝胰腺的SOD和CAT活性受温度影响显著,而外套膜受温度影响不显著。GST活性在4～12 h内随着温度升高而显著升高,而在24 h后,尤其当温度升至29°C时,GST活性显著下降。本研究推测,高温对魁蚶的能量代谢及免疫能力造成严重的影响,导致机体抗氧化能力下降,这可能是夏季魁蚶死亡率较高的一个重要原因。研究表明,魁蚶的适宜温度狭窄,建议在魁蚶养殖生产中,水温应低于23°C,超过26°C会导致机体大量的能量消耗。     

牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)间接原位杂交PCR检测方法的建立与初步应用

为建立实现牡蛎疱疹病毒(OsHV-1)在贝类宿主组织中的精确定位方法,基于原位杂交PCR (ISPCR)技术建立了OsHV-1的间接原位杂交PCR (indirect ISPCR)检测方法,并利用该方法对OsHV-1在魁蚶主要器官的分布情况进行了检测和分析。首先选择适合原位杂交PCR的引物,在载玻片上实现对原位固定靶组织内病毒DNA的稳定、特异扩增,然后与使用相同引物制作的地高辛标记核酸探针进行原位杂交,最后通过免疫酶标技术显示样本内OsHV-1的组织分布。为了达到最佳检测效果,对间接ISPCR的扩增循环数以及组织消化的蛋白酶K浓度进行优化。结果显示,最适PCR扩增循环数为20,蛋白酶K浓度为20μg/mL。利用经优化的间接ISPCR检测方法,对OsHV-1在魁蚶外套膜、鳃、肝胰腺、斧足和闭壳肌5个样本中的组织分布情况和亲嗜性进行检测和分析。病毒阳性信号主要分布于魁蚶外套膜结缔组织中浸润的血细胞和成纤维细胞、肝胰腺和鳃浸润的血细胞、斧足和闭壳肌中坏死肌肉细胞的细胞核中。本研究建立的间接ISPCR检测方法具有灵敏、特异和精确定位的优点,通过组织切片上显示的病毒核酸阳性信号,能判别OsHV-1在不同组织部位的分布特点和受感染的细胞类型;适用于OsHV-1感染的确诊、病毒对不同组织器官的亲嗜性、病毒侵染途径和致病机理等相关研究。     

魁蚶4个地理群体遗传结构的RAPD分析

应用RAPD标记技术对魁蚶Scapharca broughtonii1个韩国群体与3个中国群体的遗传多样性进行RAPD分析。对4个群体的133个个体进行扩增,共检测到171个位点。其中,多态性位点为167个,4个群体的多态性位点比例:韩国群体为86.55%、黄岛群体为90.06%、蓬莱群体为85.96%和前三岛群体为89.47%;4个群体的Shannon’s多样性指数为(0.460±0.232)~(0.491±0.214),Nei’s多样性指数为(0.308±0.171)~(0.331±0.199),表明4个群体遗传多态性较高;4个群体遗传分化指数在0.006~0.121之间。其中,韩国与中国的3个群体分化明显,说明韩国与中国3个群体的遗传结构差异较大,黄岛群体与前三岛群体间的遗传分化最小。基于4个群体Nei’s遗传距离的UPGMA方法进行聚类分析显示,黄岛群体与前三岛群体最先聚类,两群体间距离最短,再与蓬莱群体聚类,最后与韩国群体聚类。这些数据可为魁蚶种质资源的合理开发和保护及遗传改良提供科学依据。     

魁蚶过氧化氢酶基因克隆及表达分析

采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(rapid amplification of c DNA ends,RACE)克隆出魁蚶过氧化氢酶(Sb CAT)基因c DNA全长序列,该基因全长为2181 bp,包括1431 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),96 bp的5'端非翻译区(UTR)和654 bp的3'-UTR。其中ORF编码477个氨基酸,预测分子量为54 ku,理论等电点为8.03。Sb CAT氨基酸序列与其他所选动物的氨基酸序列具有较高的相似性,其相似度为68%~96%,Sb CAT氨基酸具有CAT基因家族的特征性序列,包括CAT活性位点,1个亚铁血红素结合位点及3个催化位点残基。此外,Sb CAT还具有保守的亚铁血红素结合口袋与还原型辅酶Ⅱ(NADPH)结合位点。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)检测了Sb CAT的组织表达特征。结果显示,Sb CAT m RNA在所检测的6种组织中均有表达,在外套膜中表达量较高,在肝胰腺和红细胞中表达量较低。经鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激后,鳗弧菌刺激组的外套膜表达量一直较低,其他组织均表现出先上升再下降的趋势。研究表明,Sb CAT可能在魁蚶免疫防御中发挥重要作用。