番茄Metacaspase基因(LeM)的克隆及其在大肠杆菌Rosetta中的高效表达

为获得可溶性的番茄Metacaspase蛋白,后续研究Metacaspase蛋白的酶学特性以及功能,利用RT-PCR方法克隆了番茄(Lycopersicon esculentum)中Metacaspase(LeM)全长cDNA,并成功地构建了LeM基因的原核表达载体重组质粒pET28a-LeM,转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)PlysS和Rosetta中进行诱导表达,并对诱导表达条件进行了优化.SDS-PAGE结果显示,在37℃条件下,1 mmol/L IPTG诱导表达量最高,在BL21(DE3)PlysS菌株中重组蛋白主要以包涵体形式存在,而相同条件下在Rosetta菌株中多为可溶性表达.同时酶活测定显示,Rosetta上清中LeM的活性为33 RFU/min,显著高于BL21(DE3)PlysS 7RFU/min.本实验表明,不同菌株对Metacaspase的可溶性表达有很大影响.     

莱茵衣藻type I metacaspase基因克隆及其参与调控程序性细胞死亡研究

Metacaspase是在原生动物、真菌和植物中发现的一种具有底物精氨酸/赖氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶。根据蛋白质结构特征可将metcaspase分为typeⅠ与typeⅡ两种类型,均参与调控多种植物与原生动物程序性细胞死亡。本研究根据GenBank数据库莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii) type I metacaspase基因(GenBank No. XM_001696904)序列,采用巢式PCR克隆获取type I metcaspase基因开放阅读框(ORF)序列并命名为CrMC1。CrMC1 ORF全长987 bp,推测编码1个包含405个氨基酸的蛋白质。通过与已知物种type I metacaspase氨基酸序列进行同源序列比对发现,CrMC1具有高度保守的p20、p10、连接区结构域以及精氨酸、半胱氨酸活性中心位点。研究显示,在H2O2诱导的莱茵衣藻程序性细胞死亡过程中,CrMC1表达量显著提高(P<0.05),2 h后达到峰值,3 h时下降至对照组同一水平。结果表明,莱茵衣藻type I metacaspase基因CrMC1参与H2O2诱导的莱茵衣藻程序性细胞死亡调控。