新麦草YUCCA基因克隆及其表达特性分析

【目的】克隆新麦草分蘖关键基因YUCCA并明确其表达特性,为该基因功能验证和育种利用奠定基础。【方法】以不同分蘖类型的新麦草分蘖节为材料,采用PCR法克隆新麦草YUCCA基因并进行同源序列比对,构建1300-cYFP-YUCCA过表达载体,利用烟草瞬时转染及蛋白质印迹法分析新麦草YUCCA蛋白的表达位置及表达情况,通过RNA-Seq数据及qRT-PCR分析验证YUCCA基因的相对表达量。【结果】成功克隆了新麦草YUCCA基因全长,大小为1 336 bp,最大阅读框为1 236 bp,并成功构建了1300-cYFP-YUCCA过表达载体。多序列比对结果显示,新麦草YUCCA主要与麦类作物的亲缘关系较近。表达特性分析发现,YUCCA基因在多分蘖型新麦草中的相对表达量远低于少分蘖型新麦草;与叶、根等组织相比,YUCCA基因在分蘖节中的相对表达量最高。烟草瞬时转化和蛋白质印迹法分析均显示,YUCCA蛋白可以正常表达,其亚细胞定位于细胞质中。【结论】YUCCA基因在调控新麦草分蘖中起下调作用,可用于后续YUCCA基因功能的研究。     

茶树CsSPMS基因全长cDNA克隆和时空表达分析

为探究精胺合成酶（spermine synthase,SPMS）与茶树（Camellia sinensis）耐寒性的关系,以茶树品种‘迎霜’为试验材料,利用简并引物PCR扩增技术结合5′/3′RACE方法,获得与低温胁迫相关的CsSPMS片段cDNA全长序列（GenBank登录号为KJ580429）。该序列全长1 374 bp,包含1 113 bp的完整开放阅读框（ORF）,编码371个氨基酸,预测分子量41.28 kD;构建亚细胞定位载体pJIT166-GFP/SPMS,亚细胞定位结果显示CsSPMS定位在细胞核上。荧光定量PCR分析表明CsSPMS在根、茎、叶、芽、花和果中都有表达,在根、茎中表达量较高;低温胁迫处理下不同组织CsSPMS的表达量,在叶片中2 h达到峰值,而在根中12 h达到高峰;在低温条件下4个茶树品种的耐寒性与CsSPMS表达量密切相关。     

芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框（GenBank登录号为JQ309841）,编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。     

小麦诱导抗性基因TaWIR1b的克隆及表达分析

全蚀病是小麦上一种重要的土传病害。选育和种植抗病品种是防治小麦全蚀病的根本途径,抗病基因研究是抗病育种的基础性工作。根据基因TaWIR1b(Accession no.M94959.1)的全长序列设计引物扩增‘新农19’的cDNA,获得了完整ORF,编码85个氨基酸残基,比对后发现与TaWIR1b序列同源性达100%。根据获得的TaWIR1b基因全长序列设计定量引物,分析TaWIR1b在全蚀菌胁迫条件下不同互作模式的表达特征。结果表明接种全蚀病菌后抗病小麦品种‘新农19’中TaWIR1b基因被诱导表达,接菌后3d达到峰值143.97,感病品种‘新麦19’中峰值出现在接菌后8d,表达量仅为对照的4.22倍,提示该基因可能参与小麦对全蚀病的抗病过程。     

BBTV两个株系DNA组分1的克隆及序列分析

 对在生物学特性特别是寄主范围上存在明显差异的NSP株系和NS株系的代表分离物(广州天河分离物和高州分离物)的DNA组分1进行了克隆和序列分析,结果表明:2个代表分离物的DNA组分1全序列、ORF及其编码的氨基酸序列的变异率分别为3.2%、3.1%和2.8%,从而进一步确证了可以用寄主范围来作上述2个株系的鉴定。此外,这2个株系的DNA组分1、ORF及其编码的氨基酸序列分别与肖火根等报道的中国(广东)分离物、以及亚洲组和南太平洋组各分离物进行比较,结果表明:NS株系与肖火根等报道的中国(广东)分离物的亲缘关系很密切;这2个株系与亚洲组各分离物的差异均较小,而与南太平洋组各分离物的差异均较大,它们应属亚洲组。     

斜纹夜蛾触角气味结合蛋白基因SlitGOBP2的克隆与序列分析

应用RT-PCR扩增结合RACE技术克隆获得斜纹夜蛾触角普通气味结合蛋白2(GOBP2)基因Slit-GOBP2全序列.SlitGOBP2的阅读框全长489 bp,编码162个氨基酸残基,预测分子质量和等电点分别为18.16 ku和5.43.cDNA和氨基酸序列GenBank登录号分别为EFl59979和ABM54824.SlitGOBP2氨基酸序列含6个保守的半胱氨酸位点,具有GOBP2的典型特征,与16种鳞翅目昆虫GOBP2同源性为94%～75%;编码蛋白呈酸性,整个分子呈亲水性,在第40～60位和100位以后的氨基酸表现亲脂性,蛋白质二级结构主要由a螺旋构成.氨基酸序列系统进化树分析表明,SlitGOBP2与草地夜蛾Spodoptera frugiperda和甘蓝夜蛾Marnestra brassicae的GOBP2同属于一个分支,一致性分别为94.4%和92.0%.昆虫GOBP2分子在体现保守性的同时也体现了进化性.     

本氏烟NbHSP90基因的克隆及初步功能分析

辣椒疫霉菌(Phytophthora capsici)通过与植物互作调节植物的免疫反应,进而引起植物感病。前期实验证明辣椒疫霉效应分子RxLR19781与本氏烟(Nicotiana benthamiana)热激蛋白90(NbHSP90)可以发生相互作用。利用RT-PCR技术从本氏烟中克隆得到基因NbHSP90,通过农杆菌介导的瞬时表达技术,验证NbHSP90在辣椒疫霉侵染本氏烟过程中的作用。研究结果表明:NbHSP90基因的c DNA序列全长1005 bp,编码含334个氨基酸的蛋白质,不含信号肽,无跨膜结构,具有典型的HATPase保守结构域和C端基序MEEVD。瞬时表达结果表明,NbHSP90能显著减弱辣椒疫霉在本氏烟中的定殖。研究结果为进一步阐明辣椒疫霉效应分子RxLR19781靶向本氏烟HSP90促进自身侵染的分子机制提供了依据。     

大肠杆菌Top10Na+/H+反向运输体A基因的克隆及生物信息学分析

根据细菌中存在的Na+/H+反向运输体(Na+/H+antiporterA,nhaA)的基因序列,采用PCR扩增的方法从大肠杆菌(Escherichia coli)Top10中克隆到了nhaA基因(Acession Numeber:EU368045)。nhaA开放阅读框为1 167 bp,编码含有388个氨基酸残基,分子量为41.3 kDa的蛋白,预测等电点为9.23。nhaA含有25个碱性氨基酸,19个酸性氨基酸,211个疏水氨基酸及63个极性氨基酸。二级结构预测表明,该蛋白含约50%的α-螺旋、18%的延伸链、7%的β-转角和25%的不规则卷曲。亲疏水性分析显示,nhaA是疏水性蛋白。跨膜结构进行分析显示该蛋白含有11个跨膜区域。序列分析表明,大肠杆菌Top10 nhaA基因与大肠杆菌DH5α、大肠杆菌HS、大肠杆菌SECEC SMS-3-5和大肠杆菌CFT073的nhaA基因同源性分别为100%、98%、95%和92%。大肠杆菌Top10 nhaA基因的克隆及生物信息学分析为今后对nhaA的进一步深入研究奠定了基础。     

水稻γ-生育酚甲基转移酶基因全长cDNA的克隆与分析

γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)是植物维生素E生物合成途径中的关键酶.通过RACE-PCR得到了水稻γ-TMT基因的cDNA序列,该基因的cDNA全长1 432 bp,包含一个长为1 089 bp的完整开放读码框,推导的氨基酸序列与小麦、玉米、向日葵、番茄、大豆、拟南芥的γ-生育酚甲基转移酶基因的同源性分别为90%、87%、76%、75%、74%、70%.     

甘菊CBL基因的克隆与表达分析

基于已建立的甘菊ESTs文库,检索到了CBL基因4个不同的EST序列;采用RACE技术获得了它们的全长序列,并命名为ClCBL1-4。将甘菊(Chrysanthemum lavandulifolium)ClCBL与拟南芥(Arabidopsis thaliana)的CBL进行多重序列比对发现,它们都含有4个结合钙离子的EF-hand结构域,且ClCBL1在N端有一个豆蔻酰化序列(MGCXXSK/T)。采用RT-PCR技术,分析了甘菊中CBL基因的表达与不同逆境胁迫的关系,表明甘菊CBL基因的表达在冷、干旱、热、盐及ABA胁迫中可被不同程度地诱导,而在非逆境胁迫条件下,甘菊CBL基因在根、茎、叶及花等不同器官中均有表达,且表达量相对一致。这些结果说明该家族基因参与了植物非生物逆境胁迫的抵御。