小麦果糖激酶基因TaFRK与TaPFT的互作分析

小麦赤霉病是全球性病害,严重威胁着中国的小麦粮食安全。目前已经明确的抗赤霉病位点有7个（ Fhb1~ Fhb7）。 其中 Fhb1位点是3BS染色体上稳定性和效应最大的抗扩展位点。 TaPFT是 Fhb1位点上的抗性基因之一,但其抗性机理并不清楚。本研究以TaFRK为诱饵蛋白通过酵母双杂交技术筛选小麦酵母双杂交文库,从而得到互作基因 TaFRK,其编码蛋白为果糖激酶。进一步通过构建酵母双杂交载体和双分子荧光互补载体分析 TaFRK与 TaPFT之间的互作关系,并通过qPCR分析 TaFRK受到禾谷镰刀菌孢子诱导后的表达模式。通过酵母双杂交试验发现,共转pGBKT7 - TaPFT和pGADT7 - TaFRK 的酵母菌株Y2HGlod在含有X-α-Gal和金担子素A（Aureobasidin A,AbA）的四缺培养基SD/-His-Leu-Trp-Ade上长出蓝色菌落,证明 TaFRK与 TaPFT在酵母中互作。通过双分子荧光互补试验发现,在共转YN- TaPFT和YC- TaFRK表达载体的烟草叶片中可观察到强烈的黄色荧光信号,表明 TaFRK与 TaPFT在植物细胞中能够发生相互作用。实时荧光定量PCR分析发现,禾谷镰刀菌孢子侵染抗性小麦后, TaFRK基因表达量升高,说明 TaFRK基因的表达受禾谷镰刀菌侵染诱导。本研究结果对进一步研究 TaPFT的赤霉病抗性机制具有一定的参考  价值。     

感染高粱花叶病毒甘蔗叶片cDNA文库构建及评价

为了研究甘蔗花叶病与甘蔗寄主致病的互作分子机制,利用SMART技术成功构建了感染高梁花叶病毒甘蔗叶片的cDNA文库,用于后续酵母双杂交互作蛋白筛选试验.采用Omega公司Plant RNA Kit提取感染高粱花叶病毒甘蔗叶片总RNA,经过Oligotex纯化获得mRNA,将其反转录成cDNA第一链,再在DNA聚合酶作用下,通过长距离PCR扩增双链cDNA.经SfiI酶切并去除短片段后,连接到pGADT7-SfiI载体上,成功获得初级cDNA文库,最后以初级文库100万克隆为基数扩增,得到扩增文库并提取质粒.经检测构建的文库容量为1.6×106 cfu,文库滴度2.2× 106 cfu/mL,文库cDNA插入片段长度主要分布在700～2 000 bp,文库重组率约为96％.结果表明,该文库质量较好,为筛选分离抗病功能基因及开展寄主与病毒互作的研究奠定了基础.     

酵母双杂交技术研究NS3蛋白及其与CP，SP，NSvc4之间的互作

采用RT-PCR扩增水稻条纹病毒基因NS3,构建酵母表达载体,将其分别连接酵母诱饵载体pGBKT7与酵母捕获载体pGADT7,得到重组子pGAD-NS3和pGBK-NS3。自身毒性的实验结果表明,NS3蛋白对酵母细胞无毒性,其自身也没有自激活活性,不存在自身互作。将这2个重组子分别与水稻条纹病毒外壳蛋白CP、病害特异性蛋白SP、运动蛋白NSvc4两两共转化到酵母感受态细胞AH109中,转化产物涂布营养缺陷型培养基二缺、三缺、四缺平板,后经X-a-Gal染色观察,结果表明,NS3与SP的转化产物能在三缺平板上生长并在相应培养基中变蓝色,说明NS3与SP蛋白存在互作,该结果有助于进一步研究NS3蛋白的功能及彼此的互作在水稻条纹病毒致病机理上的作用。