猪水肿病大肠杆菌F18ab菌毛A亚单位与志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位的联合表达

扩增、克隆和表达了水肿病大肠杆菌的致病因子F18ab 菌毛的主要亚单位FedA全基因(包括信号肽序列),并与现有的另一致病因子志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因(stx 2eA)连接,然后进行联合表达。同时用已制备的抗Stx 2eA 单克隆抗体和抗F18ab菌毛单克隆抗体对联合表达的融合蛋白质进行检测鉴定。     

多粘类芽孢杆菌β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl基因在大肠杆菌中的表达

为了有效地提高β-葡萄糖苷酶的活性,本实验将多粘类芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)β-葡萄糖苷酶bglA、bglB和bgl(bglA和bglB基因)基因分别连接在pET-28a上并在大肠杆菌C41中表达。将这3株重组菌分别命名为EA、EB及共表达菌株EAB,并将构建好的工程菌EA和EB按1∶1,1∶2,2∶1进行混合培养,分别比较单一酶组分、共表达及混合表达菌株的酶活。SDS-PAGE电泳图显示BglA和BglB的大小都为50ku,EA和EB混合培养的蛋白大小也为50ku,Bgl大小为100ku,表明BglA和BglB在体外不能形成蛋白复合物,只有在生物体内才能形成Bgl复合蛋白。酶活测定结果表明共表达Bgl与多粘类芽孢杆菌的酶活差异不显著,但显著高于其他组分酶活(P0.05)。刚果红染色结果也表明Bgl酶活比单一酶组分的酶活明显提高。本实验为纤维素酶多组分人工组装及集成生物工艺菌种的构建奠定实验基础。     

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

基因TBa和TBb分别编码苦荞过敏蛋白的两个亚基,构建这两个基因的表达质粒pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,表达蛋白以包涵体的形式存在。在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠,ELISA检测表明：复性后的蛋白免疫学活性得到了提高。由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法。     

O型FMDV VP1基因与山羊IL-18基因在昆虫细胞中的共表达与活性检测

以杆状病毒pFastBacTM Dual为载体,将O型口蹄疫病毒(FMDV)VP1基因和山羊白介素18(gIL-18)基因,分别插入到双表达载体的P10启动子和多角体蛋白启动子PH的下游,构建重组质粒pFastBacTMDual-gIL18-VP1,然后转化DH10Bac感受态细胞,经三重抗性与蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组质粒Bacmid-gIL18-VP1,并利用昆虫细胞进行转染。间接免疫荧光试验(IFA)检测表明gIL-18基因和VP1基因同时在同一细胞中独立表达。将共表达产物进行生物学活性分析表明,重组蛋白能够诱导山羊脾淋巴细胞生成IFN-γ抑制水疱性口炎病毒(VSV)在牛肾细胞(MDBK)上生长。本试验用Bac-to-Bac系统成功构建了同时含有gIL-18基因和VP1基因的重组杆状病毒,并在昆虫细胞中得到了高效表达,且具有良好的生物学活性,从而为下一步研究gIL-18在口蹄疫(FMD)中的免疫调节作用奠定了坚实的基础。