凡纳滨对虾E75基因可变剪切形式的鉴定与分析

E75是对虾蜕皮激素信号通路的关键调控因子。为了深入了解E75基因的结构和功能,本实验从转录组数据中筛选得到注释为凡纳滨对虾E75基因的转录本,经与基因组序列比对分析,鉴定发现凡纳滨对虾E75基因至少存在6种可变剪接体,分别命名为LvE75-1、LvE75-2、LvE75-3、LvE75-4、LvE75-5和LvE75-6。其中LvE75-1/2/4/5/6均包含DBD和LBD结构域,与果蝇E75A/C有相同的结构域,而LvE75-3仅包含LBD结构域,与果蝇E75D相同。在凡纳滨对虾蜕皮过程中,LvE75-1/2/3/4在D3～D4时期高表达,而LvE75-5和LvE75-6表达量很低。在成体组织中,LvE75各种剪切形式在所有检测的组织中均有表达,且在表皮、肠和鳃中表达较高,在肝胰脏、血细胞和淋巴组织中仅LvE75-3表达较高。实验通过双链RNA干扰LvE75基因的表达,在干扰样品中,检测到Halloween基因中的spo、phm和dib表达下调,shd表达上调,表明LvE75可能通过调控Halloween基因的表达来影响蜕皮激素的合成;同时E75基因的干扰也使同为蜕皮激素早期应答基因的Br-C基因和Ftz-F1基因表达下调,HR3基因表达上调,表明LvE75基因对蜕皮信号通路上下游基因均有作用。在LvE75基因持续干扰12 d后,凡纳滨对虾的蜕皮率显著低于对照组,而死亡率显著高于对照组,说明LvE75基因对凡纳滨对虾的蜕皮和生存具有重要作用。     

凡纳滨对虾类胰岛素肽基因的结构及表达分析

类胰岛素肽(ILP)是胰岛素超家族的成员,具有进化保守性,是影响动物生命活动的重要因子之一。本研究克隆了凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei) ILP1 (LvILP1)全长基因,mRNA长度为812 bp,其中开放阅读框长543 bp,编码180个氨基酸。序列分析显示,LvILP1蛋白预计分子量为20.81 kDa,理论等电点为9.45,不稳定系数为96.20,具有一个信号肽,没有跨膜结构,推导其为碱性、不稳定的分泌蛋白。结构预测显示,该蛋白具有胰岛素超家族保守的IlGF结构域,由N端信号肽、B链、C肽和A链组成,同时具有6个保守的半胱氨酸位点和2个断裂位点。系统进化分析显示,LvILP1与斑节对虾(Penaeus monodon) ILP7亲缘关系最近,与甲壳动物ILP1聚为一支,然后分别与无脊椎动物ILP7、脊椎动物松弛素(Relaxin)、胰岛素(Insulin)、胰岛素样生长因子(IGF)聚在一起。无脊椎动物ILP7类与外群海葵(Actinia tenebrosa) ILP的进化关系最近,表明这类ILP可能与胰岛素超家族的祖先较为相似。转录因子预测显示,LvILP1可能的转录因子为叉头框蛋白O3 (FoxO3)、糖皮质激素受体(GR)、CAAT区/增强子结合蛋白(C/EBP)、信号传导及转录激活蛋白(STAT)等;蛋白互作分析显示,LvILP1与细胞膜上的胰岛素受体(IR)、神经信号分子(VGLUT1、SYT 1_3)、糖蛋白激素(GPHB5)、鞣化激素(Bursicon)等相互作用;对这些转录因子和互作蛋白的生物功能进行分析,进而推测LvILP1可能具有调节生长发育、激素刺激反应、神经系统稳态、碳水化合物稳态、蜕皮后组织重建以及生殖发育等作用。分析发现,LvILP1在凡纳滨对虾早期发育阶段有较高表达,在成体各个组织中均有表达,但在眼柄中表达量最高。本研究结果为深入了解凡纳滨对虾ILP的基因结构、进化、功能及表达提供了重要信息,同时为凡纳滨对虾的分子育种和健康养殖提供线索。