克氏原螯虾病原菌感染发病标志性免疫及生理生化指标的筛选

为筛选克氏原螯虾(Procambarus clarkia)因受病原菌感染导致发病的标志性生理生化指标, 以嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila)为攻毒菌株, 采用半致死剂量注射感染克氏原螯虾, 分析了感染初期(12 h)、发病期(24~72 h)和感染后恢复期(90 h)血淋巴中的非特异免疫、糖类代谢、脂类代谢、蛋白质代谢及常规生理生化指标共 23 项, 结果显示, 在发病期, 8 项非特异免疫指标中, 感染组过氧化氢酶(CAT)活力和总抗氧化能力(T-AOC)在发病状态下提高显著(P＜0.01), 均值分别是空白对照组的 3.29 倍和 2.56 倍; 感染组发病期蛋白代谢指标白蛋白(ALB)和尿素(UREA) 浓度极显著提高(P＜0.01), 其浓度均值比空白对照组分别提高了 1.75 与 5.58 倍; 感染组发病期消化酶指标中淀粉酶(AMY)活力在发病过程中活性显著下降(P＜0.01), 比空白对照组下降了 74.18%; 血清中肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px) 4 种酶活力在发病期显著提高(P＜0.01), 与空白对照组比分别提高了 16.72、219.21、74.43、2.66 倍。在所检测指标中, 葡萄糖(GLU)、甘油三酯(TG)、总蛋白(TP)和脂肪酶(LPS) 4 项指标在克氏原螯虾发病过程中均变化不显著(P＞0.05)。结果表明, 克氏原螯虾血清中 CAT、T-AOC、 ALB、UREA、AMY、CK、ALT、AST 及 GSH-Px 9 项指标变化对细菌感染发病极敏感, 可作为判断其受细菌病感染发病的标志性指标。本研究结果可为克氏原螯虾患病风险评估和疾病预警提供新的技术依据。     

FTA卡保存对虾传染性皮下和造血组织坏死病毒DNA洗脱方法的优化

传染性皮下和造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus, IHHNV)是危害虾类健康养殖的重要病原,为寻找一种快捷保存及分离IHHNV DNA的方法,为后续研究提供完整的核酸材料,选用FTA (flinders technology associates)卡为保存介质,以FTA纯化试剂、TE (Tris-EDTA)缓冲液及去离子水为基础洗脱液,设计7种FTA卡黏附DNA洗脱方法,通过荧光定量PCR检测方法检验不同核酸洗脱分离效果及最低的点膜核酸量。结果显示,于4 mm2的FTA卡上,点样体积为2.5 μL,用洗脱液作为模板时,最低点膜核酸浓度需要1.47×104 copies/μL以上,可获得最佳的检测灵敏度和100%检出率的洗膜方法为50 μL TE缓冲液于95 ℃下浸洗5 min;用膜片做模板,点膜核酸浓度需要1.82×103 copies/μL以上,室温(20~25 ℃)条件下,用FTA纯化试剂洗脱3次,再用TE缓冲液洗脱2次,洗脱时间均为5 min,可获得最佳的检测灵敏度和100%的准确度。以FTA卡保存对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)、虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)、虾十足目虹彩病毒1 (Decapod iridescent virus 1, DIV1)、偷死野田村病毒(covert mortality noda virus, CMNV)、致急性肝胰腺坏死副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)核酸,测试所建洗脱方法的效果,证实了该方法对其他虾类病原核酸的洗脱具有通用性。该研究给出了FTA卡保存和洗脱IHHNV DNA的适用性方案,为野外对虾样品采集、病毒核酸样品跨区域传递的保存和运输条件提供了科学数据。