无乳链球菌研究进展

VII型分泌系统存在于无乳链球菌 (Streptococcus agalactiae) 中,其组成膜蛋白对底物蛋白的分泌转运至关重要。为此利用热敏型自杀质粒,构建了含氯霉素筛选标签的膜蛋白重组敲除载体pSET4s-ΔessA、pSET4s-ΔessB、pSET4s-ΔessC,经同源重组后,利用PCR技术筛选到了其缺失突变株-无乳链球菌ΔessA、ΔessB、ΔessC。通过菌株生长曲线分析,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较野生株 (WT) 生长过程变慢,其中ΔessA、ΔessB敲除株在生长早期有显著性差异 (P<0.01)。对ESAT6蛋白分泌影响分析显示,与WT株相比,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株ESAT6的表达量均显著下调 (P<0.01)。结果显示,ΔessA、ΔessB、ΔessC敲除株均较WT株毒力显著降低 (P<0.01)。研究表明,essA、essB、essC为无乳链球菌VII型分泌系统重要的膜蛋白,其基因缺失造成了分泌蛋白ESAT6 mRNA表达水平下降,影响了菌株毒力。     

花鲈虹彩病毒交叉引物恒温扩增检测方法的建立

【目的】花鲈虹彩病毒(Lateolabrax maculatus iridovirus,LMIV)严重威胁花鲈养殖业安全,无特效防控药物,早期诊断在LMIV防控中发挥极其重要的作用。建立一种简便、快捷、准确的现场快速诊断方法,可为LMIV的基层诊断提供技术支撑。【方法】利用交叉引物恒温扩增技术(Cross priming amplification,CPA),针对LMIV ATPase基因高保守区设计1套单交叉引物。以构建的ATPase重组质粒作为阳性模板,对反应体系中的引物浓度比,Bst DNA聚合酶、Betaine、MgSO₄、dNTP浓度,以及反应温度和反应时间进行优化;结合一次性核酸试纸条,建立可视化检测LMIV-CPA的方法。【结果】最优引物浓度比组合为交叉引物CPF1.0μmol/L,引物F3和B3均为0.4μmol/L,探针引物B1(FAM)和B2(Biotin)均为0.8μmol/L;MgSO4浓度为6 mmol/L、Betaine浓度为0.4 mol/L、dNTP浓度为0.6 mmol/L、Bst DNA聚合酶浓度为0.256 U/μL;最佳反应...     

β-葡聚糖对黄沙鳖生长性能、 免疫及抗氧化指标的影响

【目的】在绿色生态养殖条件下研究β-葡聚糖（β-glucan）对黄沙鳖（Truogx sinensis）幼鳖生长性能、 非特异性免疫和抗氧化指标的影响。【方法】选用体质量为 200（±10）g 的黄沙鳖幼鳖 180 只,随机分成 3 组, 每组 3 个重复,每个重复 20 只,分别投喂基础饲料（对照）和添加 200、1 000 mg/kg 剂量 β- 葡聚糖的试验饲料。 120 d 后对黄沙鳖幼鳖的增重量、体重与内脏比、内脏与肝脏比进行称量计算,并测定全血中过氧化氢酶,血清 中溶菌酶、碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶活性和丙二醛含量。【结果】各组的增重量、体重与内脏 比、内脏与肝脏比差异不显著。血清中溶菌酶活性 1 000 mg/kg 剂量组显著高于对照组和 200 mg/kg 剂量组,200 mg/kg 剂量组与对照组之间差异不显著。与对照组相比,碱性磷酸酶试验组显著升高。超氧化物歧化酶活力 200 mg/kg 剂量组显著高于对照组和 1 000 mg/kg 剂量组,1 000 mg/kg 剂量组与对照组差异不显著。而酸性磷酸酶、过 氧化氢酶活力和丙二醛含量组间差异不显著。【结论】饲料中添加适量 β- 葡聚糖有助于提高黄沙鳖幼鳖的非特 异性免疫功能和抗氧化水平而不影响其生长性能。     

龟源迟缓爱德华氏菌分离鉴定及灭活疫苗研制

【目的】利用从发病死亡的中华草龟(Chinemys reevesii)分离到的病原菌株制备灭活疫苗。【方法】对该菌进行培养特性、生理生化特征、16S rRNA同源性分析、药敏等试验。人工感染中华花龟(Ocadia sinensis),确定半数致死剂量(LD50)。经0.03%甲醛灭活后与铝胶3∶1制成灭活疫苗,对中华花龟进行腹腔注射免疫,测定血清抗体效价,以5LD50活菌浓度进行攻毒试验测定免疫保护率。【结果】分离鉴定该菌为迟缓爱德华氏菌。两次免疫14 d后抗体效价分别为1∶64和1∶256,在5LD50剂量攻毒后相对免疫保护率分别为60%和73%。【结论】本灭活疫苗二免的相对保护率达73%,有保护效果,可用于龟的迟缓爱德华氏菌病的预防。     

村务管理专业学生的教育管理研究

随着国家乡村振兴战略的深入实施,村务管理专业学生招生规模迅速扩大,教育管理对乡村振兴发展、学院建设、个人成长具有重要意义.从分析学生的特点和教育管理现状入手,阐述了抓好村务管理专业学生教育管理的重要意义,提出把好招考入学、教书育人、考察使用关口,做好学院内部与外部管理结合、教育管理与精准服务结合、依法依规与沟通交流结合、教育引导与更新观念结合、宣传表彰与惩戒警示结合,加强学生的教育管理工作.     

刺五加水提物抗鳜蛙虹彩病毒活性及其对大口黑鲈免疫调节作用的研究

【目的】研究刺五加水提物(Acanthopanax senticosus aqueous extract, ASAE)对鳜蛙虹彩病毒(Mandarin ranavirus, MRV)的抑制作用及其对大口黑鲈免疫调节功能的影响。【方法】用不同剂量ASAE(1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL)与MRV同时作用鳜鱼脑细胞系(SCB3),检测ASAE对MRV的抑制活性。在基础饲粮中添加5‰ASAE,连续饲喂大口黑鲈15 d,实时荧光定量PCR和流式细胞术分析ASAE对大口黑鲈免疫功能的影响,并以1×10⁷ TCID₅₀/mL MRV腹腔注射攻毒,分析ASAE抗MRV保护效果。【结果】1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mg/mL ASAE对MRV抑制率分别为95.27%、91.36%、84.55%、60.05%、32.16%和2.49%。实时荧光定量PCR结果显示,ASAE诱导大口黑鲈白介素-10(interleukin-10,IL-10)、酪氨酸激酶(tyrosine-protein kinase, Lyn)、肌...     

基于间接ELISA的鲤血清CyHV-3 pORF65抗体检测方法的建立

鲤疱疹病毒3型(cyprinid herpesvirus 3,Cy HV-3)囊膜蛋白ORF65基因全长1 785 bp,编码594个氨基酸。该研究在稀有密码子分析及信号肽与跨膜结构预测的基础上,将p ORF65中的N端信号肽与C端跨膜区段删除后进行密码子优化与基因合成,将合成的截短ORF65(truncated ORF65)插入p ET32a(+)载体,构建了p ET32a-trun ORF65;进一步采用DNAstar、ABCpred、Bepi Pred 1.0软件预测了p ORF65的5个B细胞表位优势区段,以合成的截短ORF65为模板,通过SOE-PCR将5个B细胞表位优势区段编码序列融合后插入p ET32a(+)载体,构建了p ET32a-mod ORF65。重组质粒分别转入BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blot分析,p ET32a-mod ORF65获得高效表达,表达的融合蛋白分子量为56.4 k D。此外,利用r Protein G亲和层析纯化了锦鲤(Cyprinus carpio haematopterus)血清Ig M,免疫小鼠,制备了鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体。在上述研究的基础上,将纯化的p ORF65作为包被抗原,鼠抗锦鲤Ig M多克隆抗体作为检测抗体,建立了间接ELISA方法,该方法可以检测p EGFP-ORF65 DNA疫苗免疫锦鲤后产生的特异性抗体。     

罗非鱼源无乳链球菌S-核糖基高半胱氨酸酶基因（1uxS）的克隆及其推导蛋白的三维结构预测

利用PCR技术对罗非鱼源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）S-核糖基高半胱氨酸酶（1uxS）基因全长DNA进行了扩增、克隆和序列测定,采用ExPAsy软件包预测了推导蛋白的特性,利用SwisS—Model服务器建立了luxS三维结构,利用Swiss—PDBviewer软件进行了蛋白质三维结构的分析。预测结果显示,罗非鱼源无乳链球菌luxS推导蛋白包括保守的酶活性中心和锌结合位点,具有影响生物被膜形成、毒力因子调控等特性功能;经拉氏构象图（Ramachandranplot）分析,所构建的z眦s的空间结构合理。     

罗非鱼源无乳链球菌S-核糖基高半胱氨酸酶基因（luxS）的克隆及其推导蛋白的三维结构预测

利用PCR技术对罗非鱼源无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)S-核糖基高半胱氨酸酶（luxS）基因全长DNA进行了扩增、克隆和序列测定,采用ExPAsy软件包预测了推导蛋白的特性,利用Swiss-Model服务器建立了luxS 的三维结构,利用Swiss-PDBviewer软件进行了蛋白质三维结构的分析。预测结果显示,罗非鱼源无乳链球菌luxS推导蛋白包括保守的酶活性中心和锌结合位点,具有影响生物被膜形成、毒力因子调控等特性功能;经拉氏构象图（Ramachandran plot）分析,所构建的luxS的空间结构合理。     

鲢抗菌肽Hepcidin的基因克隆和表达及抑菌活性分析

利用同源克隆的方法从鲢（Hypophthalmichthys molitrix）的肝脏中克隆出抗菌肽Hepcidin cDNA（GenBank登入号KF312213）后,通过pET32a（+）构建含抗菌肽Hepcidin的重组质粒的pET-Hep/Rosetta菌株,在37 ℃、28 ℃和16 ℃下分别用0.5 mmolL-1和1.0 mmolL-1 IPTG诱导表达,产物用Ni SepharoseTM亲和层析柱纯化并进行体外抑菌试验。鲢Hepcidin cDNA总长度755 bp,ORF为282 bp,5'UTR为108 bp,3'UTR为365 bp,编码93氨基酸,信号肽24个氨基酸,前域42个氨基酸和成熟肽27个氨基酸。pET-Hep/Rosetta在28 ℃和16 ℃主要是可溶性表达,37 ℃主要是包涵体表达。纯化的产物经15% SDS-PAGE电泳验证为目的产物。目的产物、pET32/Rosetta产物以及氟苯尼考的体外抑菌试验表明,目的表达产物对无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila)等具有很好的抑菌效果。