投入液氮前的平衡温度及时间对兔胚冻后存活的影响

本研究旨在了解投入液氮前的平衡温度及时间对兔胚冻后存活的影响。经0.5M蔗糖与1.5,2.0或2.5M乙二醇组成的冷冻液处理后的兔胚,在-30℃或-37℃平衡10或20分钟后即投入液氮保存或直接投入液氮保存。胚胎解冻在37℃的水浴进行。当平衡温度由-30℃下降到-37℃时,胚胎的冻后形态正常率及存活率均极显著下降(P<0.01)。在-30℃平衡20分钟与10分钟的冻后存活率无明显差异(P>0.05),但直接投入液氮时,冻后存活率则很低(8.3％)。由此表明:兔胚冻前在-30℃平衡10—20分钟是必要的。     

屡配不孕荷斯坦母牛超数排卵的试验

用加拿大生产的FSH对屡配不孕荷斯坦母进行超数排卵处理,取得良好的超排效果。处理5头,共冲出30枚卵,每头平均6枚,其中可用胚胎为21枚,每头平均4．2枚。     

C型利钠肽及其受体在水牛卵泡中的表达分析

为了探明C型利钠肽（C-type natriuretic peptide,CNP）及其受体（natriuretic peptide receptor,NPR）在水牛卵泡中的表达模式,本研究首先采用实时荧光定量PCR技术检测水牛卵巢中利钠肽家族主要成员A型、B型、C型利钠肽（ANP、BNP、CNP）及其Ⅰ型、Ⅱ型受体（NPR1、NPR2）的mRNA表达情况,然后利用免疫组化技术对水牛卵泡中CNP及NPR2蛋白进行定位,最后利用实时荧光定量PCR技术检测颗粒细胞和卵丘细胞中CNP及NPR2的mRNA表达规律。结果显示,水牛卵巢主要表达CNP及NPR2,且在各级卵泡中均有表达,其中,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,NPR2主要在卵丘细胞中表达;颗粒细胞上CNP mRNA表达水平显著高于卵母细胞周围的卵丘细胞（P<0.05）,而卵丘细胞上NPR2 mRNA表达水平显著高于颗粒细胞（P<0.05）。综上所述,在利钠肽主要家族成员和受体中,CNP和NPR2在水牛卵巢中呈现强表达,CNP主要在壁层颗粒细胞中表达,而NPR2主要在卵母细胞周围的卵丘细胞中表达。     

山毛豆草粉颗粒料对肉兔的饲用价值评定

为探讨山毛豆(Tephrosia candida)草粉对肉兔的饲用价值,将60只新西兰青年肉兔分为5组,分别添加0％(对照),10％,20％,30％和40％的山毛豆草粉制成全价颗粒饲料,饲喂90 d后测定各组饲料的营养成分及肉兔采食量、日增重、料重比和屠宰性能.结果表明:山毛豆营养生长期粗蛋白含量为17.77％,肉兔对山毛豆中粗蛋白的消化率为78.09％,山毛豆的可消化总养分为56.18％.与对照组相比,添加20％草粉日增重达到20.80 g·d-1(P＜0.01);料重比为4.45∶ 1(P＜0.05);屠宰率为57.78％(P＜0.01);单位kg增重平均最低饲料成本差异显著(P＜0.05).因此,添加20％山毛豆草粉制成全价颗粒饲料可显著提高肉兔的生产性能和养殖效益.     

猪SMYD3基因的克隆、序列分析及其对猪成纤维细胞增殖的影响

试验旨在克隆猪SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)基因并对其进行序列分析,研究其对猪成纤维细胞增殖的影响。首先克隆猪SMYD3基因,根据其他物种SMYD3基因siRNA和shRNA序列,经同源性比对分析,获得两条猪SMYD3基因shRNA序列,分别构建pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA1/shRNA2表达载体,转染HEK293T细胞,利用实时荧光定量PCR分析干扰效率,筛选出抑制效率较好的shRNA,并构建pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体,同时分析SMYD3基因对猪成纤维细胞的增殖作用,检测细胞Nanog、DNMT1及DNMT3a基因表达情况。结果显示,试验克隆得到1 404 bp的猪SMYD3基因编码区序列,生物信息学分析发现,德保猪SMYD3基因与野猪、山羊和野耗牛相应氨基酸序列的同源性分别为99.5%、93.8%和92.9%。shRNA1/shRNA2均能显著抑制SMYD3基因表达(P0.05),抑制效果分别是34%和54%,选择pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA2进行后续研究。通过脂质体转染法将构建的pLVX-IRES-ZsGreen1-SMYD3及pSicoR-GFP-SMYD3 shRNA真核表达载体导入HEK293T细胞,均可观察到清晰的绿色荧光。慢病毒感染细胞及实时荧光定量PCR结果显示,与空白对照组及阴性对照组相比,过表达SMYD3基因促进猪成纤维细胞增殖,Nanog和DNMT1基因表达显著升高(P0.05);抑制SMYD3基因表达,细胞增殖受到抑制,Nanog、DNMT1、DNMT3a基因表达显著降低((P0.05),说明SMYD3基因的表达与猪成纤维细胞的增殖显著相关。     

激活方法对水牛卵母细胞孤雌发育的影响

系统探讨了几种激活方法对水牛卵母细胞孤雌发育的影响。体外成熟 (IVM) 2 6 h的水牛卵母细胞经 7%乙醇(EH)、钙离子载体 (A2 3187)或离子霉素 (Ion)激活处理 5 min后 ,在 2 m mol/ L 6 -甲二氨基嘌呤 (6 - DMAP)中培养 3～4 h,然后再继续培养 6～ 11d,观察其胚胎发育情况。结果发现 ,5μmol/ L Ion激活处理的水牛卵母细胞分裂率显著高于 EH处理的卵母细胞 (6 3.0 % vs5 4 .2 % ,P<0 .0 5 ) ,其原核形成率也显著高于 EH处理的卵母细胞。激活处理前 ,无Ca2 培养液孵育时间的长短 ,对水牛卵母细胞孤雌发育无显著影响 (P>0 .0 5 )。如用 A2 3187激活处理水牛卵母细胞 ,其激活分裂率则随着浓度的升高而提高。从而表明 ,5 μmol/ L Ion可有效激活水牛卵母细胞     

水牛黑色素皮质素1受体基因克隆、生物信息学分析及表达模式研究

本试验旨在对水牛黑色素皮质素1受体(MC1R)基因进行克隆、生物信息学分析及表达模式研究。参考牛MC1R基因(GenBank登录号:JN123363.1)序列设计引物,以本地沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛基因组DNA为模板,应用PCR方法扩增克隆MC1R基因片段并进行测序分析。运用QRT-PCR方法检测摩拉水牛、沼泽水牛、白沼泽水牛和黄牛皮肤组织中MC1R基因的表达模式,并通过Western blotting方法检测沼泽水牛和白沼泽水牛MC1R基因的蛋白表达差异。结果表明,应用PCR方法成功克隆了水牛MC1R基因,其编码区全长954 bp,共编码317个氨基酸。测序分析后发现沼泽水牛、白沼泽水牛、摩拉水牛和黄牛MC1R基因的核苷酸序列和氨基酸序列相似性很高。沼泽水牛与白沼泽水牛在476、618、881、930和931 bp位点上分别发生T→C、G→C、G→A、G→A和A→G突变,导致了沼泽水牛和白沼泽水牛第159位氨基酸由丝氨酸变成苯丙氨酸,第310位氨基酸由谷氨酸变成丙氨酸,第294位氨基酸由天冬氨酸变成丙氨酸,发生了非同义突变。QRT-PCR结果发现,MC1R基因在摩拉水牛、沼泽水牛和黄牛皮肤组织中的相对表达量均显著高于白沼泽水牛(P<0.05);Western blotting分析结果显示,沼泽水牛皮肤组织中MC1R蛋白的表达量高于白沼泽水牛。综上所述,白沼泽水牛MC1R基因的编码区发生氨基酸位点突变,且相对表达量和蛋白表达量均低于沼泽水牛,推测此为白沼泽水牛体内合成的黑色素缺失而导致毛色白化的主因。     

马MC1R基因多态位点与毛色相关性分析

旨在研究马MC1R基因多态位点与马毛色的关联性,为马的毛色育种提供重要的理论参考依据。本研究采集了10种不同毛色共132匹马的颈静脉血,提取基因组并应用PCR技术克隆MC1R基因编码序列,通过限制性长度多态性(RFLP)分析和测序分析,对马MC1R基因多态性与毛色进行关联分析,并预测了SNPs对其编码蛋白结构的影响。构建和分析了MC1R基因的系统发育树。结果发现,马MC1R基因存在3个多态位点,其中c.G102A为同义突变,c.C248T和c.G250A为错义突变。c.C248T造成MC1R蛋白的第83个氨基酸由极性亲水丝氨酸变为非极性疏水苯丙氨酸,预测突变后该位点氨基酸与第三跨膜区的第127个氨基酸(丝氨酸)之间的氢键消失而改变了MC1R的蛋白构象,该突变导致MC1R基因出现EE、Ee和ee 3种基因型。错义突变c.G250A导致其翻译的氨基酸由天冬氨酸变为天冬酰胺,该位点突变后与邻近氨基酸及跨膜域作用力复杂,推测比只出现c.C248T突变对MC1R蛋白功能的影响要小,该位点突变导致出现基因型ee~a。综合NCBI中的马MC1R基因型数据(共571匹)与其毛色性状进行相关性分析发现,在骝毛马和黑毛马群体中存在EE和Ee两种基因型,青毛马群体中存在EE、Ee、ee和ee~a基因型,栗毛中存在ee和ee~a两种基因型。黑毛和骝毛马的基因型分布差异极显著(P0.01),呈现Hardy-Weinberg不平衡,等位基因E为优势等位基因;在栗色马中未检测到E等位基因,e为优势等位基因。MC1R基因系统发育树分析显示,EE基因型个体与家马、普氏野马相似性最高。本研究结果显示,马MC1R多态位点产生的不同基因型与马的骝毛、黑毛、栗毛及以这3种毛色为基础毛色的花马毛色存在相关性,骝毛马与黑毛马中不存在基因型ee,栗毛马中则不存在等位基因E。为应用基因型对马的毛色进行定向选择育种奠定了基础。     

不同细胞因子对水牛原始生殖细胞传代培养的影响

为探讨不同细胞因子对水牛原始生殖细胞（PGCs）传代培养的影响，将PGCs分别采用A、B、C、D、E、F和G共7种培养基进行培养，即A组：基础液＋10ng／mL白血病抑制因子（LIF）＋10ng／mL碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）；B组：基础液＋20ng／mL LIF＋20ng／mL bFGF；C组：基础液＋20ng／mL LIF＋10ng／mL bFGF；D组：基础液＋20ng／mL LIF；E组：基础液＋20ng／mL LIF＋20ng／mL bFGF＋20ng／mL干细胞因子（SCF）；F组：基础液＋20ng／mL LIF＋40ng／mL bFGF＋40ng／mL SCF；G组（对照组）：基础液。将机械法分离的PGCs小集落接种到水牛胎儿成纤维细胞（BEF）饲养层上进行传代培养。结果，原代时，A、B、C、D、E和F组的克隆数目都显著高于对照组（P％0．05），其中E和F组的克隆数目显著高于A组（P〈0．05），而与B、C、D组差异均不显著（P〉0．05）；1～8代时，B、C、D、E、F组的克隆数目显著高于A组（P〈0．05）；对照组传代数仅为2代，A组为5代，而B、C、D、E和F组均为8代以上。结果表明，在传代过程中，LIF起主要作用，20ng／mL的LIF浓度可以满足水牛PGCs传代培养的需要。     

水牛卵母细胞去核方法的比较

水牛卵母细胞体外成熟22h后，分别用盲吸法、点击法和纺锤体成像系统（Spindle—View System）去核。结果，三者的去核率分别为65．1％、81．8％和95．0％，差异极显著（P〈0．01）。以水牛胎儿成纤维细胞为供体，通过核移植构建的重构胚的融合率、分裂率和囊胚发育率，在上述3种方法之间均没有显著差异（P〉0．05）。认为点击法是一种较为简单、实用和有效的去核方法。