1只秦岭地区野外捕获野猪重要猪源病毒的检测及PCV2分离株基因序列分析

病毒病是严重危害养猪业的重要疫病,秦岭山中存在大量野猪,其携带猪源病毒的情况尚不明确。本研究对1只从秦岭山中救治的野生仔猪携带的几种猪重要病毒进行了检测。分别采集了野猪的血液、口腔拭子、眼拭子、鼻拭子及肛门拭子样品,通过PCR或RT-PCR方法分别检测了猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒1型(PCV1)和2型(PCV2)核酸,对检测阳性的病毒进行了分离。克隆了PCV2分离株的全基因序列,进行了全基因序列分析。结果显示,在所有类型样品中均未检出CSFV、PRRSV和PPV核酸;在血液中均检测到PCV1、PCV2和PRV核酸;在肛门拭子和口腔拭子中检测到PCV2核酸,口腔拭子中还检测到PCV1核酸;眼拭子和鼻拭子中未检出目标病毒核酸。将血液处理后接种PK15细胞进行病毒分离,细胞盲传8代后,可观察到细胞出现CPE,收集细胞后通过PCR可以检测到PCV1、PCV2和PRV核酸阳性。PCV2分离株的全基因序列长度1 767bp,序列分析表明该分离株与从发现该野猪地区养猪场分离的9个PCV2分离株的全基因同源性在99.3%以上,与GenBank上登录的PCV2陕西株的全基因同源性为96.0%~99.6%,从全基因的同源性分析,可以推测该PCV2野猪分离株极有可能来自家养猪。本研究初步发现,秦岭地区的野猪携带有来自家猪的重要病毒,在该地区家猪传染性病毒病的防控中应考虑通过野猪携带和扩散病毒的问题。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株（Y16155-1株）的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6 h即可检出PCV2核酸,72 h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10^-4.3 TCID₅₀/0.2 mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

猪圆环病毒2型河南株全基因组的克隆与序列分析

利用PCR方法,对河南郑州、南阳、焦作等地采集的疑似猪圆环病毒2型（PCV2）感染的病料进行检测。PCR检测为阳性的病料经处理后,接种无PCV污染的PK-15细胞中盲传6代,克隆11株PCV2全基因组并进行序列分析。结果表明,11株PCV2中有10株基因组全长为1 767bp,基因组分型为PCV2b,1株为1 768bp,说明PCV2b是河南省断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）发生的主要因素;11个毒株的同源性位于94.9%～100%,与其他毒株的同源性为94.7%～100%;10株基因组为1 767bp的毒株处于一大分支上,遗传进化比较稳定;本试验为PCV2在河南地区的分子流行病学、遗传变异及防治奠定了基础。     

猪圆环病毒2型的分离鉴定及优化培养

为研究圆环病毒病的流行情况及防治奠定基础,从湖北省某些大型养猪场采集临床上表现为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)病死猪的淋巴结、脾等组织病料,进行病毒分离和鉴定。对分离病毒进行了间接免疫荧光鉴定、电子显微镜鉴定、核苷酸序列比对分析及动物感染试验;同时对病毒的培养条件进行优化,用RT-PCR检测感染细胞中的病毒核酸含量。结果表明,从猪病料中分离到1株猪圆环病毒2型(PCV2),命名为PCV2-WH。分离毒株经间接免疫荧光可检测到特异的PCV2荧光斑,电子显微镜下可观察到直径17 nm大小、圆形病毒粒子;利用一对圆环病毒2型ORF2基因引物进行了PCR扩增,将所得序列与GenBank收录的9株圆环病毒2型ORF2基因的核苷酸序列比对,同源性为98.2%～99.9%。非免疫猪接种出现明显的临床症状和病理变化。优化培养的结果显示,细胞与病毒同步接种培养24 h后,用300 mmol/L D-氨基葡萄糖于37℃作用30min后继续培养48 h的病毒滴度最高。本研究为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究奠定了基础。     

适合猪圆环病毒2生长的PK15均质细胞株的构建

<正>为筛选出PCV2培养滴度最高的PK15细胞克隆株,采用稀释法从PK15混合细胞中分离单细胞克隆株,获得的细胞克隆用于接毒试验,即用同步接种法将猪圆环病毒2(PCV2)病毒细胞混合液以1∶100的比例接种单克隆细胞,接毒后经PCR与定量PCR检测得出A10细胞克隆培养PCV2,获得的病毒含量最高。将A10细胞进行第     

猪圆环病毒2型GD株ORF2基因的序列分析

根据GenBank中猪圆环病毒2型（PCV2）0RF2基因序列，设计一对引物，应用PCR从本室鉴定分离的PCV2 GD株的细胞培养物中扩增出ORF2基因（702bp）。将此基因片段克隆入pMD18-T载体，筛选获得重组质粒pMD—ORF2并对其测序，结果表明所克隆的ORF2基因与其他PCV2的0RF2基因核苷酸序列同源性在92．1％～99．9％之间，推导的氨基酸序列同源性在90．2％～99．5％之间。     

猪圆环病毒2型2015JS株的分离鉴定及全基因序列分析

采用细胞传代法对PCR检测为猪圆环病毒2型(PCV2)阳性的病料进行病毒分离,通过PCR、间接免疫荧光试验(IFA)对分离的病毒进行初步鉴定,应用IFA测定分离株的TCID50。应用PCR特异性扩增出该分离株的全基因组,经测序后进行同源性和系统进化分析。结果:成功分离到1株PCV2毒株,全基因组长度为1 766 bp,命名为2015JS株,分离株在细胞上的TICD50为10-5.50,与乌拉圭毒株Uy99(Gen Bank登录号KP867050)的同源性最高(99.8%),同属PCV2d型;与丹麦PCV2c毒株DK1980PMWSfree(Gen Bank登录号EU148503)的同源性最低(94.3%)。研究结果为江苏PCV2流行病学的研究和遗传变异的防控提供了参考资料,也为江苏PCV2疫苗毒株提供了选择依据。     

猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定

从临床表现为仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PMWS）淋巴组织病料，经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪圆环病毒2型（PCV2）感染，采用无污染的猪肾细胞系（PK15）分离培养，并连续传代培育成一株细胞培养适应毒，命名为PCV2／LG株。分离毒株经细胞培养，于第25代后毒价显著升高，于第35代毒价可达10^5.6TCID 50/mL。采用免疫过氧化物酶单层细胞染色法（IPMA）、免疫电镜技术、分子克隆及核酸序列分析等鉴定表明，分离株感染细胞后病毒抗原主要分布在细胞核及细胞质中；病毒感染的阳性细胞呈散在分布，阳性细胞数可达50％以上；免疫电镜观察到与PCV2特异抗体结合形成的病毒免疫复合物呈实心小颗粒样粒子团，病毒粒子直径约为17nm；病毒抗原基因组由1768个核苷酸组成，与GenBank登录的8个PCV2基因组序列同源性达96．2％以上。用2mL的病毒细胞培养物（10^5.6TCID 50/mL）接种30日龄PCV2抗体阴性仔猪3头，可引起典型PMWS临床症状。本研究为进一步开展该病毒的致病性、疫苗免疫、诊断及分子生物学等研究奠定了基础。     

致病性猪伪狂犬病病毒PRV-JF株的分离与鉴定

从临床疑似猪伪狂犬病发病仔猪的脑组织病料中，经聚合酶链式反应（PCR）证实为猪伪狂犬病病毒（PRV）野毒感染，采用无PCV1污染的猪肾细胞系（PK-15）分离培养，经蚀斑克隆纯化，培育1株细胞培养适应毒，命名为PRV-JF株。该分离株经细胞培养传代，能够产生典型的细胞病变，病毒滴度随代次显著增加，第24代毒价达10^8.5 TCID50／mL。免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）检测病毒抗原分布在细胞核及细胞质内。病毒感染细胞可被已知PRV阳性血清中和。电镜负染观察到病毒粒子呈椭圆或圆形外观，无囊膜的病毒粒子直径约110nm～150nm，有囊膜的成熟病毒粒子直径约150nm～180nm。PCR鉴定该毒株含有gE基因，其序列与GenBank登录的7株PRV同源性为97.7％～100％。用不同剂量病毒培养物接种家兔于24h～72h内全部死亡。研究表明，PRV-JF分离株对易感动物具有高致病性，为进一步开展该病毒流行病学、致病机理、疫苗免疫与诊断研究奠定了基础。     

天津及周边地区猪圆环病毒2型流行情况调查及分离鉴定

为了调查天津及周边地区猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)的感染情况及其分子特征,本研究应用PCR方法对疑似PCV2感染病例开展调查,将阳性病料接种dulac细胞分离病毒,应用PCV2 ORF2基因特异性引物对分离的PCV2进行PCR扩增,克隆、测序后进行核苷酸序列同源性分析。结果显示,不同地区PCV2的阳性率为25.0%~38.1%,其中夏季的阳性率明显高于其他3个季节,达到44.0%;不同阶段猪群中,育肥猪群的PCV2阳性率最高,而哺乳母猪相对较低。经细胞分离得到24株PCV2,其ORF2序列与GenBank中PCV2序列的同源性为87.8%~99.2%,24株分离株之间的同源性为89.4%~100.0%;遗传进化分析显示,24个分离株归属于2个分支。对其中一株分离毒株(Y16155-1株)的体外增殖特性研究表明,第4代接种dulac细胞后6h即可检出PCV2核酸,72h病毒含量达到高峰,病毒滴度为10-4.3 TCID50/0.2mL。本试验结果为进一步研究该地区PCV2分子流行病学及相关疾病的免疫防控奠定了基础。     

猪圆环病毒2a/2b亚型病毒株毒力分析

本研究对367份猪内脏样本进行PCV2检测,对阳性样本进行2a/2b鉴别诊断,并采用ORF2测序方法对部分阳性样本进行测序。在发病猪群中PCV2b阳性率远高于健康猪群,而健康猪群中PCV2a的阳性率高于发病猪群,从而在临床表型方面论证了PCV2b毒力强于PCV2a。通过比较12株PCV2 ORF2推导氨基酸序列的关键氨基酸位点,9株PCV2b毒株在ORF2氨基酸76位为I,131位为T;而3株PCV2a毒株在ORF2氨基酸76位为L,131位为P,据比对结果可知,PCV2b毒株为强毒株,PCV2a毒株为弱毒株。研究结果表明,PCV2的2种亚型2a/2b无论是临床表型还是ORF2基因型,毒力表现都是有差异的,且PCV2b毒力要强于PCV2a。     

Detection of porcine Circovirus type 2 (PCV2) variants PCV2-1 and PCV2-2 in Brazilian pig population

In the present study whole genome of six Brazilian isolates of PCV2 were sequenced, analyzed and compared with 35 other sequences (24 from other countries and 17 from Brazil). The phylogenetic analysis showed that mostly Brazilian variants of PCV2 were grouped as PCV2-1. Two isolates among the six analyzed here could not be grouped with any other PCV2-2 analyzed in this study. One of these isolates was from an aborted fetus with myocarditis and the other from a PMWS affected pig. The results pointed here showed that both groups of PCV2 are present in Brazilian pig population without any clear geographical correlation.     

过氧化氢对成肌细胞的氧化损伤作用研究

旨在以体外培养的小鼠成肌细胞(C2C12)为研究对象,探讨氧化损伤可能的路径。本试验分为3个处理组,每个处理组6个重复。处理组分别为:对照组(Control),以DMEM培养基培养的细胞作为空白对照,培养24 h;吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)组(PDTC),以每个孔1 mL的PDTC(20μmol·L^-1)孵育细胞24 h;H_2O_2组(H_2O_2),加入0.5 mmol·L^-1的H_2O_2处理细胞24 h。检测各组细胞的存活率、ROS水平与凋亡率,采用荧光定量PCR和蛋白免疫印记法检测细胞凋亡和自噬相关基因的表达以及NF-κB信号通路相关因子的表达。结果表明,与对照组相比,PDTC可显著提高细胞的总凋亡率(P<0.05),可显著上调细胞半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)、caspase-6、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1的mRNA表达量和微管相关蛋白1轻链3(LC3)-II/I的值以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著下调核因子kappa B副族1(p50)、B型白细胞/2型淋巴细胞样蛋白(Bcl-2)、v-rel禽网状内皮增生病病毒癌基因同源物A(RelA)和环氧合酶(Cox)-2的mRNA表达量以及NF-κB蛋白表达水平(P<0.05);H_2O_2可显著提高细胞的ROS水平和细胞总凋亡率(P<0.05),可显著上调caspase-3、caspase-6、caspase-8、caspase-9的mRNA表达量以及caspase-3蛋白表达水平(P<0.05),显著上调Beclin 1和LC3-II/LC3-I的mRNA表达量以及LC3-II蛋白表达水平(P<0.05),显著提高Bcl-2相关X蛋白(Bax)的mRNA表达量(P<0.05),显著下调p50、Bcl-2、RelA和Cox-1、Cox-2的mRNA表达量以及核因子kappa B(NF-κB)蛋白表达水平(P<0.05)。结果提示,H_2O_2会引起C2C12细胞的ROS升高,并且能够通过抑制NF-κB信号通路介导细胞凋亡和自噬的发生,这与NF-κB因子的特异性抑制剂PDTC的作用相类似。     

Effect of porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccination on PCV2-viremic piglets after experimental PCV2 challenge

The objective of this study was to evaluate the effect of porcine circovirus type 2 (PCV2) vaccines on PCV2-viremic and -seropositive piglets born from naturally PCV2-infected sows against postnatal PCV2 challenge. The experimental design was aimed at mimicking commercial swine rearing conditions to evaluate the response of the PCV2 vaccine on PCV2-viremic and -seropositive piglets after experimental PCV2 challenge. PCV2a (or 2b)-viremic piglets received a PCV2 vaccine at 21 days of age followed by a PCV2b (or 2a) challenge at 49 days of age (28 days post vaccination). The PCV2 vaccines elicited a high level of humoral (as measured by immunoperoxidase monolayer assay and neutralizing antibody titers) and cellular (as measured by the frequency of PCV2-specific interferon-γ-secreting cells) immune response in the PCV2-viremic piglets after vaccination even in the presence of maternally derived antibodies (MDA). The initial infection of PCV2 in the pigs was not affected by PCV2 vaccination, however the challenging PCV2 was reduced by PCV2 vaccination on PCV2-viremic pigs. The results from this study demonstrate that the PCV2 vaccine used in this study is effective at reducing PCV2 viremia and lymphoid PCV2 DNA, even for PCV2-viremic pigs with passively acquired MDA at the time of vaccination.     

猪圆环病毒2型ORF2/猪白介素2嵌合表达质粒在猪体内诱导的保护性免疫反应

为探讨猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2/猪白介素-2(PoIL-2)嵌合重组表达质粒(rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2)在猪体内的免疫效果和免疫保护效果进而研制高效PCV2核酸疫苗,将35只10日龄健康仔猪平均分成7组分别以rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2重组表达质粒或PCV2ORF2基因原核表达的rCap蛋白进行免疫及免疫保护试验。共进行4次肌肉注射免疫,每次间隔2周;于第4次免疫后3周通过口腔和鼻腔途径感染PCV2细胞强毒。分别于第4次免疫后和攻毒后不同时间通过检测免疫猪血清抗体水平和外周血T淋巴细胞增殖活性、辅助性T细胞(Th)和细胞毒性T细胞(Tc)亚群的百分含量、排毒率和病毒血症阳性维持时间等指标以评价其免疫和免疫保护效果。结果表明,各免疫组猪均产生了抗PCV2特异性ELISA免疫抗体,但rCap蛋白免疫组猪抗体水平较低;rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒对猪体的免疫和免疫保护效果显著优于rpcDNA3.1/ORF2质粒;在rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒或rpcDNA3.1/ORF2质粒中添加rCap蛋白对重组质粒免疫及免疫保护效果无明显影响。因此,选取rpcDNA3.1/PCV2-linker-PoIL-2质粒为下一步研制PCV2核酸疫苗的主要成分。     

H2O2与Fe2+、Cu2+、Zn2+协同作用对桑自由基伤害和保护酶活性的影响

研究了H2O2与Fe2+等金属离子产生的自由基胁迫对桑树生理特性的影响,旨在为桑树的抗逆栽培提供理论参考。以桑树叶片为材料,研究H2O2与Fe2+、Cu2+、Zn2+协同作用对桑自由基伤害和保护酶活性的影响。结果表明:经H2O2-Fe2+、H2O2-Cu2+和H2O2-Zn2+3种体系溶液处理的桑.OH含量分别提高34.38%、8.14%和5.43%;O2.-含量分别降低78.77%、54.75%和63.84%;1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)清除率分别降低44.60%、57.34%和54.64%;超氧化物歧化酶(SOD)活性分别提高44.45%、36.02%和28.28%;多酚氧化酶(PPO)活性分别降低68.18%、86.58%和54.78%;过氧化氢酶(CAT)活性分别降低97.46%、96.57%和68.02%;过氧化物酶(POD)活性分别降低22.22%、提高7.42倍和66.67%。H2O2与Fe2+等的协同作用破坏了桑细胞内自由基动态平衡,导致自由基含量提高,保护酶活性受到显著影响。