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相似文献
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1.
李娇  王艳  唐娜  沈志强 《养猪》2011,(6):93-96
猪瘟单克隆抗体以其敏感性高、特异性强、能够识别病毒抗原结构的微小差异,同时单抗特有的理化同质性使抗原抗体反应结果便于质量控制、利于标准化和规范化等优点,在猪瘟病毒的诊断以及强弱毒鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出良好的应用前景。本文就猪瘟单克隆抗体及其在猪瘟诊断中的应用进展作一综述。  相似文献   

2.
单克隆抗体在猪瘟诊断上的应用   总被引:2,自引:1,他引:1  
猪瘟单克隆抗体以其敏感性高、特异性强、能够识别病毒抗原结构的微小差异,同时单抗特有的理化同质性使抗原抗体反应结果便于质量控制,利于标准化和规范化等优点,在猪瘟的诊断以及强、弱毒鉴别诊断中得到了广泛应用,显示出了良好的应用前景。论文就猪瘟单克隆抗体及其在猪瘟诊断中的应用进展作一综述。  相似文献   

3.
非洲猪瘟(ASF)传播对我国生猪养殖造成重大危害,开发用于ASF诊断产品已刻不容缓。本研究为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)pK205R蛋白单克隆抗体,构建了能表达ASFV pK205R蛋白的工程菌BL21/pET-pK205R。经IPTG诱导,可表达可溶性的pK205R蛋白。经SDS-PAGE检测,获得的蛋白大小为25 kDa左右。经Western blot鉴定,纯化后的蛋白可与ASFV阳性血清发生特异性反应。以纯化的ASFV pK205R蛋白作为抗原免疫BALB/c小鼠,制备了12株针对ASFV pK205R蛋白的单克隆抗体。经间接ELISA方法鉴定,单克隆抗体的效价均不低于1∶80 000。单克隆抗体重链亚类分别为IgG1及IgG2b,轻链亚类均为κ。通过间接免疫荧光试验(IFA)测定12株单克隆抗体均不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流行性腹泻病毒存在交叉反应,且均能与ASFV反应。本研究为建立快速检测非洲猪瘟病毒感染的诊断方法奠定了基础。  相似文献   

4.
为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。  相似文献   

5.
非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的制备及初步应用   总被引:1,自引:1,他引:0  
为制备非洲猪瘟病毒(ASFV)p62蛋白的特异性单克隆抗体,并初步应用于感染组织样品中ASFV抗原的免疫组化(IHC)检测,本研究以杆状病毒表达的非洲猪瘟病毒重组p62蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的p62蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了18株可稳定分泌抗非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经IFA检测,制备的单克隆抗体均与非洲猪瘟病毒反应,且不与猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型等猪源常见病毒反应,特异性良好。抗体识别蛋白的鉴定结果显示,3株MAbs识别p35蛋白,15株MAbs识别p15蛋白。14株MAbs重链亚类为IgG1型,4株MAbs重链亚类为IgG2a,轻链均为κ链。利用18株MAbs对ASFV感染猪的肺、扁桃体、淋巴结等组织进行IHC检测,结果显示5株MAbs均能够与感染ASFV的组织发生特异性的免疫反应。本研究获得的非洲猪瘟病毒p62蛋白单克隆抗体可为非洲猪瘟病毒免疫学检测方法的建立及p62蛋白的结构功能等基础研究提供重要的生物材料。  相似文献   

6.
非洲猪瘟病毒pS273R蛋白水解酶单克隆抗体制备   总被引:1,自引:0,他引:1  
本研究旨在制备非洲猪瘟病毒(ASFV) S273R蛋白的特异性单克隆抗体。本研究以原核表达的非洲猪瘟病毒重组S273R蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合获得杂交瘤细胞。结果显示:基于纯化的S273R蛋白建立的间接ELISA方法对杂交瘤细胞进行筛选和亚克隆,获得了4株可稳定分泌抗ASFV S273R蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并通过免疫印迹(Western blot)和免疫荧光试验(immunofluorescence assay,IFA)测定了其免疫特性。4株单克隆抗体亚类均为IgG1型,轻链均为κ链。本研究获得的非洲猪瘟病毒S373R蛋白单克隆抗体可为进一步研究ASFV pS273R的生物学功能及基因缺失毒株的鉴别诊断和疫苗开发提供技术储备。  相似文献   

7.
猪瘟病毒E2糖蛋白A1抗原亚区的表达   总被引:7,自引:0,他引:7  
猪瘟病毒(CSFV)囊膜结构糖蛋白E2(gp55)是诱导机体产生中和抗体及激发保护性免疫应答的主要抗原蛋白。E2存在4个不同抗原区(A-D),根据中和特性和保守性差异,将A抗原区进一步划分为A1、A2、A3抗原亚区,A1抗原亚区在不同猪瘟病毒分离毒株中高度保守且诱导的单克隆抗体具有中和特性。本采用pRSET C载体,对A抗原区2744nt~2947nt(791aa~858aa)基因片段(EC)进行克隆、表达,并分析表达产物的免疫反应性。研究发现:EC表达产物能与抗猪瘟病毒Alfort毒株E2蛋白的中和性单克隆抗体c2410发生特异性结合,且此结合能被猪瘟病毒抗原或阳性血清阻断。结果表明:A1抗原亚区位于E2蛋白791~858位氨基酸区域。  相似文献   

8.
应用纯化的猪瘟病毒疫苗免疫Balb/c小鼠,以重组的E2和E0蛋白为检测抗原,筛选制备了17株抗猪瘟病毒的杂交瘤细胞株。用猪瘟病毒石门毒接种PK-15细胞,以制备的17株单克隆抗体进行间接免疫荧光实验,结果显示有7株单抗呈现良好特异性荧光染色。  相似文献   

9.
将大肠杆菌表达的猪瘟病毒重组E^rns蛋白经纯化后作为包被抗原,建立了检测猪瘟抗体的E^rns-ELISA方法。经优化试验,确定了最适抗原包被量为0.15 μg;血清最适稀释度为1:100。经阻断试验、交叉反应试验和重复性试验证明,建立的E^rns-ELISA简便、特异、稳定,与基于重组E2蛋白的E2-ELISA的符合率高达96.7%,与基于全病毒抗原的Dot-ELISA符合率为77.5%。可以用于猪瘟抗体的血清学监测以及用作基于E2蛋白的标记疫苗配套的鉴别诊断。  相似文献   

10.
目的制备抗猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)单克隆抗体并对其生物学特性进行鉴定。方法以纯化的PRRSV全病毒抗原免疫BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术制备单克隆抗体,并测定其免疫球蛋白亚类、效价和特异性。结果成功获得2株能稳定分泌抗PRRSVM蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞,命名为3C3、3D2,经鉴定亚类均为IgG2a、kappa链。2株单克隆抗体腹水ELISA效价达105~107,IPMA效价达1:2560~1:10240,与猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒等无交叉反应。结论获得特异性针对猪繁殖与呼吸综合征病毒的单克隆抗体,为研究该病的快速诊断技术奠定基础。  相似文献   

11.
4 SPF BALB/c mice were immunized with purified classical swine fever virus (CSFV) as the antigen and mouse splenic cells were fused with SP2/0 cells. Hybridoma cells were screened by ELISA and semi-solid agar cloning, 4 hybridoma cells secreting anti-CSFV monoclonal antibodies were obtained. ELISA results showed that all of these monoclonal antibodies with high antibody titer, which could specifically react to CSFV but not cross react to other pig viruses and PK-15 cell cultures. Western blotting indicated that 3 strains of monoclonal antibodies reacted with CSFV specially. Specific green fluorescence was observed in the cell membrane by IFA. This study layed a foundation for the development of new diagnostic reagents for CSFV.  相似文献   

12.
单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立   总被引:9,自引:0,他引:9  
分别用原核表达的猪瘟病毒(CSFV)主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6.间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应.将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板(捕捉抗体),与兔抗CSFV IgG(检测抗体)联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA(AC-ELISA)方法.随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值.最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%.  相似文献   

13.
周顺  李俊  温建新 《中国动物检疫》2010,27(8):24-26,44
基于猪瘟病毒主要保护性抗原E2囊膜糖蛋白有两个相对独立的抗原结构单位B/C抗原区和A/D抗原区,根据GeneBank中猪瘟病毒B/C基因核苷酸序列设计合成一对引物,经RT-PCR扩增猪瘟病毒B/C基因。将扩增所得猪瘟病毒B/C基因克隆于PMD18-T载体,然后定向亚克隆猪瘟病毒B/C基因至原核表达载体PET30(a)的多克隆位点中,经酶切鉴定后,将含有B/C基因的重组质粒命名为PETB/C。用PETB/C转化受体菌BL21,挑取单个菌落,用诱导剂IPTG以不同浓度进行诱导,并在不同诱导时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实B/C基因获得了表达,并在终浓度为1mM的IPTG,诱导6h其表达达到高峰,经Western-blot分析证实表达的重组B/C蛋白具有反应活性,大小约为9KD。用表达产物作ELISA,结果表明表达产物与猪瘟病毒抗血清可发生明显的反应,而与其它8种疫病阳性血清不发生反应。正常菌体蛋白与猪瘟病毒阳性血清也不发生反应。通过对58份送检血清样品的检测结果显示其与Dot-ELISA的相符率高达95%以上。试验证明利用原核表达系统制备的重组蛋白作为诊断用抗原,为研究亚单位疫苗或诊断抗原打下坚实基础。  相似文献   

14.
猪瘟病毒E2蛋白A/D区单抗的制备及其抗原表位的初步研究   总被引:5,自引:0,他引:5  
应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E(A),在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E(A),以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选,获得了C3、A1两株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA结果显示,其腹水效价为1∶128000和1∶256000。Western blotting结果证实,单克隆抗体C3和A1能与猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)发生特异性的反应,表明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白的保守线性表位。  相似文献   

15.
为制备猪细小病毒VP2蛋白单克隆抗体(McAb),建立检测猪细小病毒的抗原捕捉ELISA方法 (AC-ELISA),本研究以原核表达的重组VP2蛋白作为免疫原,免疫6周龄BALB/c雌鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经间接ELISA方法筛选,成功获得了2株能稳定分泌抗猪细小病毒VP2蛋白的McAb,命名为3C4、5F8。以多克隆抗体作为捕获抗体、单克隆抗体5F8作为检测抗体,通过双抗夹心ELISA各个反应条件的优化,建立检测猪细小病毒抗原捕捉ELISA方法。该方法与日本乙脑病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)均不发生交叉反应;与RT-PCR相比较,符合率、敏感性和特异性分别为93.6%、90.9%、94.4%。本研究建立的猪细小病毒AC-ELISA有良好的重复性、敏感性和特异性,可应用于猪细小病毒感染的早期诊断。  相似文献   

16.
The phenotypic changes in circulating leukocytes in swine fever influenced by classical swine fever virus (CSFV) infection with different strain virulence was studied in piglets. The phenotypic differences were measured by monoclonal antibodies specific for porcine differentiation antigens. The pattern of phenotypic change varied with the virulence of CSFV. Infection with virulent, but not the attenuated strain of CSFV resulted in the dramatic early loss of CD8-bearing T lymphocytes from the circulation. A similar trend was also seen in the gammadelta T-cell compartment following infection with the highly virulent strain, Washington. The loss of circulating B-lymphocytes was consistent with the failure to generate neutralising antibody. These observations contrasted the finding that the number of leukocytes expressing the CD4 surface antigen increased in piglets infected with CSFV. These data provide preliminary information on the potential range of leukocyte changes produced in piglets following infection with CSFV.  相似文献   

17.
以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。  相似文献   

18.
猪瘟病毒(CSFV)的E2蛋白是引起猪体产生针对猪瘟保护性抗体的主要抗原,构建可稳定表达CSFV E2蛋白的细胞系,可为E2蛋白功能研究及基因工程猪瘟疫苗的研制提供物质基础。本研究将CSFV E2基因克隆至慢病毒表达载体,构建重组慢病毒表达质粒pCDH-E2。将pCDH-E2重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染BHK-21细胞,经嘌呤霉素抗性筛选结合有限稀释法筛选出可表达CSFV E2蛋白的BHK细胞系。Western blot分析结果显示,所构建的重组细胞系传至第10代仍能稳定表达CSFV E2蛋白。该细胞系的建立为研制猪瘟新型重组疫苗及其生产奠定基础。  相似文献   

19.
猪瘟单克隆抗体的制备及ACI-ELISA检测猪瘟病毒的研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
本研究用猪瘟石门毒(CSFV-Shimen)免疫BALB/C小鼠,按常规单克隆抗体(McAb)技术方法制作,最终获得4株McAb,分别命名为AC9、CF8、DG5和EC9,4株McAb与基因工程CSFV E2蛋白反应结果表明:AC9、CF8和EC9是抗CS-FV E2蛋白的McAb.用AC9和CF8McAb对CSFV进行抗原捕获间接ELJSA试验(ACI-ELISA),通过一元McAb和二元McAb CAI-ELISA试验的比较,结果表明AC9与CF8两种McAb有协同作用,其捕获CSFV的能力比一元McAb显著提高.方阵试验结果表明:McAb和血清多抗(PcAb)的最佳工作稀释度分别为1:400和1:200.特异性试验和敏感性试验结果显示本法特异性强,敏感性高.最后用ACI-ELISA与PCR对30份病料的检测结果比较,表明ACI-ELISA与PCR检测结果相符.上述结果说明本研究所获得AC9和CF8可用作猪瘟诊断试剂盒的研制,是检测CSFV的有效方法.  相似文献   

20.
本研究旨在建立定量检测猪瘟病毒(CSFV)E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA方法。用 CSFV WH303单克隆抗体包被96孔酶标板,用CSFV 1B6单克隆抗体连接HRP作为酶标抗体,以杆状病毒表达纯化的CSFV E2蛋白作为标准品蛋白,建立双抗体夹心ELISA定量方法。用SDS-PAGE方法检测标准品蛋白的纯度,BCA蛋白定量法定量标准品蛋白的浓度。稀释标准品至线性区间,绘制标准曲线。用棋盘法确定包被单克隆抗体和酶标抗体及标准品蛋白的最适稀释度。用批间重复和批内重复试验验证该方法的重复性和稳定性。SDS-PAGE结果显示,CSFV E2蛋白的标准品纯度>95%,BCA蛋白定量法测定CSFV E2蛋白的标准品浓度为1.553 mg/mL。包被单克隆抗体的浓度为0.1 μg/mL,酶标抗体的最适稀释度为1∶400。CSFV E2蛋白标准品稀释浓度在2.43~77.65 μg/mL范围内有很好的线性关系,相关系数R2值在0.99以上。批间和批内重复性检测试验变异系数均<15%。本试验成功建立了定量检测CSFV E2重组蛋白的双抗体夹心ELISA检测方法,该方法具有良好的重复性和稳定性,为CSFV E2蛋白的定量提供了有效方法。  相似文献   

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