应用复合多聚酶链反应方法快速鉴别伪狂犬病弱毒疫苗与野毒

本研究根据伪狂犬病病毒（ＰｒＶ）共有ｇＢ和疫苗株缺失的ｇＥ基因序列分别设计合成１对通用（ＰＢ１／ＰＢ２）和１对鉴别引物（ＰＥ１／ＰＥ２）,以在我国广泛使用的疫苗株Ｂａｒｔｈａ－Ｋ６１及从国内外收集的野毒株Ｓ、ＳＵ、Ｆ、Ｌ、Ｙ、Ｍｉｎ－Ａ、Ｓｈｏｐｅ、Ｓ（川）、ＳＬ１、１０＃、ＥＡ（鄂Ａ）ＤＮＡ为模板在同一反应管中同时扩增ｇＢ和ｇＥ基因序列建立了复合多聚酶链反应（ＰＣＲ）方法。ＰＣＲ产物经２．０％琼     

伪狂犬病病毒(PrV)糖蛋白gE基因在重组杆状病毒中的表达

应用ＰＣＲ方法扩增出１．８Ｋｂ的伪狂犬病毒糖蛋白ｇＥ基因,克隆到ｐＵＣ１１９中形成重组质粒ｐＲＺＥ。经测序鉴定后再将ｇＥ基因定向亚克隆到杆状病毒转移载体ｐＶＬ１３９２中,形成重组质粒ｐＶＬｇＥ。将ｐＶＬｇＥ与杆状病毒线性ＤＮＡ（ＢＡＣ－Ｎ－Ｂｌｕｅ ＤＮＡ）共转染Ｓｆ９昆虫细胞,经三轮蚀斑纯化,获得重组病毒ｒｐＶＬｇＥ。通过ＰＣＲ方法鉴定证明ｇＥ基因正确插入到杆状病毒基因组中,直接免疫荧光试验和Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ结果表明ｇＥ基因在重组杆状病毒感染的Ｓｆ９昆虫细胞中获得高效表达。表达的ｇＥ蛋白将作为伪狂犬病强毒的ｇＥ基因缺失弱毒疫苗鉴别诊断ＥＬＩＳＡ方法的抗原,为进一步扑灭伪狂犬病发挥重要作用。     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的…

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒）、对病毒进行纯一提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆人ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／Ｓａｌ Ｉ双酶切法、ＰｓｔＩ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，ａｑｔ     

表达马立克氏病病毒CV1988／Rispens糖蛋白B重组鸡痘病毒的免？…

用表达马立克氏病病毒（ＭＤＶ（Ｉ型疫苗株ＣＶ１９８８／Ｒｉｓｐｅｎｓ糖蛋白Ｂ（ｇＢ）基因的重组鸡痘病毒（ｒＦ－ＰＶ－ｇＢ／Ｒ）和鸡痘病毒（ＦＰＶ）疫苗株２８２Ｅ４免疫１日龄不同品种的鸡,来评价２种病毒株的安全性及免疫母源抗体的商品是我毒性,而对无毒源抗体的ＳＰＦ鸡的毒性则不同。斑点杂交和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交产,ｆＦＰＶ－ｇＢ／Ｒ中无氨苄青霉素的抗性基因。     

牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因序列，应用ｏｌｉｇｏ４．１程序设计一对引物ＰＢ１／ＰＢ２，分别对ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲ病毒ＤＮＡ均有３９９ｂｐ的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染必喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增。均未见特异性条带，证     

新城疫病毒融合蛋白裂解位点基因的分离克隆及在原核细胞中的表达

用ＳＰＦ鸡胚繁殖新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４６Ｅ９株（强毒）、ＬａＳｏｔａＥ４株（弱毒），对病毒进行纯化，抽提ＲＮＡ。用１对均为２７个碱基的引物进行ＲＴ－ＰＣＲ，扩增出了２个毒株的融合蛋白裂解位点（Ｆｃ）基因。将Ｆｃ基因定向克隆入ｐＵＣ１８的ＥｃｏＲＩ和ＳａｌⅠ位点之间，获得２个毒株Ｆｃ基因克隆ｐＵＣＦ４６Ｆｃ和ｐＵＣＬａＦｃ，用ＥｃｏＲＩ／ＳａｌⅠ双酶切法、ＰｓｔⅠ单酶切法、ＰＣＲ法和核酸探针法对其进行了鉴定。将鉴定好的ＬａＳｏｔａＥ４Ｆｃ基因定向导入表达载体质粒ｐＢＶ２２１，获得重组子ｐＢＶＬａＦｃ。ＰＣＲ和内切酶酶切法鉴定表明，Ｆｃ插入的位置和方向都正确无误。用Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５α通过热诱导法进行了表达。用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ法检测了表达产物。结果表明，有１条能够与ＮＤＶ多抗反应的特异条带，分子量约１５７００，与预期大小一致，说明是Ｆｃ基因的表达产物     

伪狂犬病基因缺失疫苗株(SA215)某些生物学特性研究

本试验测定了伪狂犬病ｇＥ－／ｇＩ－／ ＴＫ－／ ＬａｃＺ＋基因缺失疫苗株（ＳＡ２１５）的致细胞病变效应、安全性、免疫原性和免疫期等生物学特性。试验结果显示,该疫苗株能在Ｖｅｒｏ细胞上适应生长,并形成典型的蚀斑。其对１日龄仔猪、怀孕母猪、牛、羊以及家兔安全,无不良接种反应,接种动物不向体外散毒。ＳＡ２１５疫苗接种猪能抵御高剂量（１０７ＰＦＵ）Ｆａ株强毒感染,攻毒后试验猪的发热期、增重受阻天数、散毒滴度均低于Ｂａｒｔｈａ株疫苗接种猪,远远低于对照组猪。ＳＡ２１５接种猪能维持长时间的高水平中和抗体滴度,免疫期可达半年以上。试验结果表明,ＳＡ２１５株是一株安全、免疫原性好、免疫期长的疫苗株。     

PCR法检测血清I型马立克氏病病毒及其敏感性试验的研究

以人工合成的针对血清Ｉ号马立克氏病病毒（ＭＤＶ１）Ａ抗原基因（ｇＡ）部分序列的两端寡聚核苷酸为聚合酶链反应（ＰＣＲ）的引物，分别对马立克氏病病毒血清Ｉ型（京－１株，ＭＤ１１／７５Ｃ株）；２型（ＳＢ－１株）；３型（火鸡疱疹病毒的ＦＣ１２６株）毒株和ＧＡ株ＢａｍＨＩ Ｂ片段的ＰＡＣＹ１８４克隆重组质粒ＤＮＡ进行基因扩增反应及其敏感性试验。结果表明，该引物不仅对ＭＤＶ１具有较强的特异性，而且由此引物引导     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性敢管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列，应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２，分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行了ＰＣＲ扩增，结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增产生４５７ｂｐ的特异性片段，而ＴＫＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ     

减蛋综合征病毒套式PCR检测技术的研究

从ＧｅｎｅＢａｎｋ的１段含六邻体蛋白基因、蛋白酶基因、ＤＮＡ结合蛋白基因的序列中，应用Ｐｒｉｍｅｒ软件设计了２对引物。用这２对引物在分别对反应体系成分和聚合酶链反应（ＰＣＲ）试验条件进行优化后，成功地建立了减蛋综合征病毒（ＥＤＳＶ）套式ＰＣＲ检测技术。对鹌鹑源ＥＤＳＶＱＡＶｃ－９４株、ＡＶ－ｘｂ西北分离株、ＡＶ－１２７国际标准株扩增结果，第一轮ＰＣＲ得到约２９０ｂｐ的特异性片段，第二轮ＰＣＲ得到约９０ｂｐ的片段，与预期２８９ｂｐ、８９ｂｐ的设计相符合。而传染性腔上囊病病毒（ＩＢＤＶ）疫苗株Ｂ８７、鸡亲城疫病毒（ＮＤＶ）Ⅳ系疫苗株（ＬａＳｏｔａ）和正常尿囊液等对照的扩增结果均未显示任何扩增条带，有很好的特异性。所建立的套式ＰＣＲ检测方法具有特异、快速的优点，其灵敏度比常规ＰＣＲ灵敏１００倍，可检测出０．０１ｆｇ的