13/17罗伯逊易位猪成纤维细胞系的建立

为了在细胞水平上研究13/17罗伯逊易位猪群这一种质资源,试验采用组织块分离法对13/17罗伯逊易位杂合子猪、纯合子猪及正常核型家猪耳组织进行了分离培养,构建了3个成纤维细胞系,并对其进行了形态学、生长动力学、核型分析、绿色荧光蛋白报告质粒转染和微生物污染检测等生物学特性研究。结果表明:3种核型家猪细胞形态均为标准成纤维细胞形态,细胞内波形蛋白呈现阳性表达;细胞生长曲线均呈"S"型;杂合子猪细胞染色体2n=37所占比例为92.5%,纯合子猪细胞染色体2n=36所占比例为93.8%,正常核型家猪细胞染色体2n=38所占比例为96.3%;外源质粒能在细胞中进行稳定表达;细菌、真菌、病毒、支原体检测结果呈阴性。说明本研究已成功建立13/17罗伯逊易位猪成纤维细胞系。     

13/17罗伯逊易位猪生长抑素基因的多态性研究

采用微量全血培养法制备染色体标本,对13/17罗伯逊易位猪的3种杂交组合的309头后代进行核型鉴定,结果样本中存在3种核型的猪：正常核型猪（2n=38）、易位杂合子猪（2n=37）和易位纯合子猪（2n=36）;利用PCR SSCP技术检测发现生长抑素基因外显子1不存在多态性;其内含子的266～602 bp片段存在2个突变位点(T520C,G521T),但仅检测到2种基因型：AA和AB。遗传多态性分析结果表明,不同杂交组合后代及不同核型的猪群中AA基因型频率（频率范围为0.58～0.77）和A等位基因频率（频率范围为0.79～0.90）均显著高于其AB基因型频率（0.23～0.42）和B等位基因频率（0.10～0.21）;易位杂合子猪的AB基因型频率（0.42）均高于正常猪（0.25）及易位纯合子猪（0.40）。经卡方检验,差异不显著（P>0.05）,群体的基因型频率处于哈代－温伯格平衡状态。     

13/17染色体易位纯合子猪(2n=36)与正常核型家猪(2n=38)的杂交试验

用13/17染色体易位杂合子猪互交获得的1头13/17染色体易位纯合子公猪[2n=36,XY,rob(13/17)]与4头正常核型母猪(2n=38,XX)交配,结果4头母猪全部妊娠并正常分娩.其产仔数分别为13,16,12,11,产活仔数分别为12,13,12,11;窝断奶头数分别为12,13,9,10.经核型鉴定,其后代全部为13/17易位杂合子[2n=37,XX或XY,rob(13/17)].此结果表明,13/17易位染色体的遗传完全符合孟德尔的遗传规律,13/17易位纯合子公猪具有正常的繁殖力.本杂交试验所产活仔48头,其性别比例为35?:13?,接近3:1的比例,经X~2检验不符合1:1的理论比率(X~2=10.08,P<0.01).此外,本杂交试验所产仔猪生长发育正常,并具有一定的杂合优势,这一结果为13/17易位纯合子猪的进一步推广应用,尤其是作为商品猪生产的杂交父本提供了可靠依据.     

13/17易位杂合子猪互交后代主要生理生化指标测定

1991年2月我们获得3窝13/17易位杂合子猪互交后代,经核型鉴定发现有3种不同核型,即正常核型(2n=38,XX或 XY)、13/17易位杂合子[2n=37,XX或XY,rob(13/17)]、13/17易位纯合子[2n=36,XX或XY,rob(13/17)].为了进一步探明13/17易位纯合子及杂合子的种质特性,我们对这3种核型的11项生理生化指标进行了测定.     

13/17易位纯合子猪培育成功

1990年10月我们用2头13/17易位杂合子公猪与4头13/17易位杂合子母猪交配,其中3头受孕.1991年2月相继产仔,3窝共产仔29头,到2月龄存活24头.经核型分析,发现有3种核型,其中13/17易位纯合子猪8头,其核型为:2n=36,XX或XY,rob(13/17);13/17易位杂合子猪10头,其核型为:2n=37,XX或XY,rob(13/17);正常核型猪6头,其核型为:2n=38,XX或XY.     

猪13/17罗伯逊易位染色体的显微分离及DOP-PCR扩增

以13／17罗伯逊易位杂合子猪[2n=37，XY或XX，rob（13：17）]为材料，制备其有丝分裂中期染色体，利用显微分离技术对13／17罗伯逊易位染色体进行分离，并将单条染色体进行简并寡核苷酸引物PCR（degenerate oligonucleotide primer-PCR．DOP-PCR）扩增，其扩增片段大小主要在0．2～2．5kb之间；以DOP-PCR扩增产物为模板，分别以猪13、17号染色体近着丝点微卫星标记S0282和SW335为扩增目的基因，对D0P-PCR扩增产物进行鉴定，结果表明DOP-PCR产物来源于13／17罗伯逊易位染色体。该方法的成功建立为进一步从分子水平上研究家猪13／17罗伯逊易位所引起的表型效应的遗传机制以及筛选猪13和17号染色体上新的分子遗传标记奠定了基础。     

用RAPD技术研究9个家猪群体的遗传结构

利用RAPD技术对9个家猪群体的遗传多样性进行研究，包括13／17罗伯逊易位纯合子猪、易位杂合子猪及正常核型猪的3个群体、丹系长白猪群体、加系双肌臀杜洛克猪群体、加系双肌臀大约克猪群体、加系双肌臀长白猪群体、及欧洲猪与易位杂合子猪产生的2个杂交后备猪群体。用17条已筛选出的产生多态性的随机引物对模板DNA进行扩增，共得到384条清晰稳定的多态型片段，片段长度在200～4000bp之间。根据多态性结果计算出群体间的共有带率F及遗传距离指数D，并以此绘制出群体的亲缘关系树状聚类图，确定了它们间的亲缘关系。     

猪单条13/17罗伯逊易位染色体的显微分离与LA-PCR扩增

以13/17罗伯逊易位纯合子猪［2n=36，XY或XX，rob(13;17)］为试验材料，制备其有丝分裂中期染色体，利用显微分离技术对13/17罗伯逊易位染色体进行分离，并将单条染色体进行LA-PCR扩增，其扩增片段大小主要在200~2800 bp；对LA-PCR扩增产物用猪13、17号染色体近着丝点微卫星标记SWR1941和SWR1120与Southern杂交2种方法进行鉴定，结果表明LA-PCR产物来源于13/17罗伯逊易位染色体。该方法的成功建立为进一步从分子水平上研究家猪13/17罗伯逊易位所引起的表型效应的遗传机制以及筛选猪13和17号染色体上新的分子遗传标记奠定了基础。     

13/17染色体易位纯合子猪群随机扩增多态性DNA指纹分析

利用 6 0条随机引物对 13/ 17罗伯逊易位纯合子猪、易位杂合子猪及正常核型猪的群体基因组 DNA进行了RAPD分析 ,筛选出 2 2个产生多态性的随机引物 ,计算出 3个群体间及群体内的共有带率 (F)及遗传距离指数 (D) ,并以此绘制出群体的亲缘关系树状图。对群体的遗传多样性进行了研究 ,计算出遗传多样性指数 (Ho) ,并在此基础上进行了 t检验 ,结果表明了该群体的变异情况。该群体的变异主要来源于群体间的变异 ,群体间的变异大于群体内的变异。利用 RAPD技术可快速有效地检测亲缘关系较近的猪群体的 DNA多态性 ,RAPD技术在猪的基因组研究中有广阔的应用前景     

家猪染色体13/17易位的发现及表型效应的研究——Ⅱ.家猪染色体13/17易位的表型效应

对13/17易位杂合子猪与同场同期同品种非易位猪的繁殖力、生长发育进行了统计分析.13/17易位杂合子公猪的窝产仔数、初生窝重、20日龄窝重、断奶窝重、窝断奶头数,无论纯繁还是杂交,与非易位猪均无显著性差异(P>0.05).13/17易位杂合子母猪作为杂交母本,其繁殖力与同场同期同品种非易位母猪无显著性差异(P>0.05).在13/17易位杂合子公猪的后裔中,13/17易位杂合子猪的20日龄重、断奶重都与非易位猪差异不显著(P>0.05).13/17易位杂合子公猪6月龄的体高显著高于非易位公猪的体高(P<0.05),但体重、体长和胸围均无显著性差异(P>0.05).13/17易位公猪的女儿与非易位公猪的女儿6月龄的体重与体尺也无显著性差异.本文还提出了对家畜染色体易位的育种措施.     

家猪13/17罗伯逊易位染色体遗传规律的研究

本研究采用微量全血培养法对１３／１７ 染色体易位猪的５ 种交配组合所产３４２ 头后代的染色体组型进行了分析。结果表明,家猪１３／１７ 罗伯逊易位染色体的遗传符合孟德尔遗传规律,且具有稳定的遗传性。１３／１７ 易位纯合子互交后代仍然为１３／１７ 易位纯合子;１３／１７ 易位杂合子互交后代出现１３／１７ 易位纯合子（２ｎ ＝ ３６） ,１３／１７ 易位杂合子（２ｎ ＝ ３７） 和正常核型家猪（２ｎ ＝ ３８） 三种核型,经卡方检验符合１ ２ １ 的理论比值。本文还讨论了家猪和野猪的染色体进化,１３／１７ 罗伯逊易位染色体的应用。     

种公牛1/29染色体罗伯逊易位的检测结果及其遗传效应分析

通过对夏洛来、利木赞、西门塔尔三个品种共98头种公牛染色体的遗传检测，在加系夏洛来牛中发现一例1／29染色体罗伯逊易位纯合种公牛及后代1／29罗伯逊易位杂合母牛一例。讨论了1／29染色体罗伯逊易位对繁殖性能的影响。三品种种公牛Y染色体均为中部着丝点，X染色体有中部着丝点和亚中部着丝点两种类型，在品种间呈多态性。     

13/17罗伯逊易位纯合子、杂合子猪及3个引进品种核仁组成区(Ag-NORs)的多态性

对 1 3/ 1 7易位纯合子猪、杂合子猪及杜洛克、长白、约克夏猪的核仁组成区 ( Ag-NORs)的多态性作了研究 ,结果表明 ,杜洛克、约克夏猪 Ag-NORs定位于 8号和 1 0号染色体的次缢痕区 ,而 1 3/ 1 7易位纯合子猪、1 3/ 1 7易位纯合子猪×约克夏猪 F1代 Ag-NORs的遗传方式符合孟德尔定律 ;Ag-NORs在细胞间、个体间及品种间数目均有差异 ,而且品种差异显著大于品种内个体间差异。 1 3/ 1 7易位纯合子猪、杂合子猪 ,以及长白、杜洛克、约克夏猪 Ag-NORs均数分别为 1 .99、1 .98、2 .0 0、2 .0 5、2 .0 6,说明 Ag-NORs在品种、个体及细胞间具有多态性。这种多态性与猪的起源和杂交育种时所用亲本品种的血缘成分有关 ,因此可作为遗传标记 ,用以分析家畜的亲缘关系     

基因多态性与经济性状的相关分析

利用外周血淋巴细胞培养制备染色体标本,对13/17罗伯逊易位猪的3种杂交组合的394头后代猪进行分群;应用PCR RFLP技术在〖STBX〗POU1F1〖STBZ〗基因的扩增片段（1746 bp）中检测到1个RsaⅠ限制性内切酶的多态酶切位点A（3种基因型）;应用PCR SSCP技术检测1个〖STBX〗POU1F1〖STBZ〗基因第5内含子上的突变E（2种基因型）,同时结合生长和胴体品质测定记录研究基因型对生产性状的遗传效应。结果表明,位点A的基因型对生长有显著影响（P<0.05）,位点E基因型对生长和眼肌面积有显著影响（P<0.05）。研究结果初步揭示POU1F1多态性与生长、眼肌面积等存在相关,推测POU1F1多态性可作为罗伯逊易位杂合优势遗传机制的一种分子水平上的解释。     

香猪SRY基因的克隆及序列分析

试验参照猪SRY基因保守序列设计了1对引物,对香猪基因组DNA进行PCR扩增。将扩增产物通过T—A互补法克隆到质粒pGEM—T载体中,筛选阳性克隆进行DNA测序。测序结果显示,香猪SRY基因开放阅读框全长627bp,编码227个氨基酸。其中核心区域HMG—box长237bp,并且编码79个氨基酸。与白鲸、人、牛、绵羊4种哺乳动物的SRY基因序列相比较,香猪和白鲸的SRY序列具有较高的相似性,相似度达82．1％。序列相似性和邻接法聚类树的结果均显示,在SRY基因中香猪和白鲸有着较近的亲缘关系,表明以白鲸为代表的鲸目和以香猪为代表的偶蹄目有较近的亲缘关系。     

麦洼牦牛SRY基因克隆及序列分析

SRY是Y染色体上具体决定生物雄性性别的基因片段,是多数哺乳动物性别决定基因之一。本试验采用克隆测序SRY基因并结合生物信息学对其序列进行分析,利用软件Codon W分析麦洼牦牛、普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡和人该基因编码区的密码子偏好性。克隆测序得到SRY基因序列含1个690 bp的开放阅读框,共编码229个氨基酸;其编码区核苷酸序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、小鼠、鸡、人相应序列间的一致性分别为99.9%、93.9%、91.2%、76.5%、43.3%、21.4%、69.1%。经聚类分析,麦洼牦牛首先与普通牛聚在一起,绵羊与山羊聚为一类,这两类相聚后再依次与猪、人、小鼠相聚,最后与鸡聚为一类,其结果与以往的生物学分类结果一致。该基因编码的蛋白质分子式为C₁₁₅₅H₁₈₂₇N₃₅₁O₃₄₈S₁₁,相对分子质量为2655.0,理论等电点PI为9.55,亲水性平均数为-0.855。其密码子偏好性分析显示,T3_s为0.2905、C3_s为0.3240、A3_s为0.3728、G3_s为0.2963,第3位碱基中出现G和C占第3位碱基总量的48%,同义密码子数为61。上述数据表明麦洼牦牛SRY基因编码序列与普通牛、绵羊、山羊、猪、人具有较高的一致性,在物种进化过程中较为保守。该基因对含A的密码子有较高的偏爱性,尽量避开以G结尾的密码子,且其所编码的蛋白质为亲水性蛋白。