牛病毒性腹泻病毒的基因分型

根据病毒基因组５＇端非翻译区（ＵＴＲ）的序列比较将牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）分成两组。种系发生分析说明ＢＶＤＶ－１和ＢＶＤＶ－Ⅱ组互有不同，根据５＇端非翻译区和编码ｐ＾１２６多肽的基因区，设计了用ＰＣＲ鉴别ＢＶＤＶ－Ｉ和ＢＶＤＶ－Ⅱ。用该试验，１４０株ＢＶＤＶ毒株中有７６株被鉴定为ＢＶＤＶ－Ⅱ，并注意到ＢＶＤＶ－Ｉ和ＢＶＤＶ－Ⅱ之间的抗原性和病原性差别，ＢＶＤＶ－Ｉ普遍用于疫苗生产、诊断试验和研     

牛病毒性腹泻病毒P20和P14基因的克隆及序列分析

参考GenBank中BVDV Oregon C24V株的基因组序列设计两对引物,利用套式PCR方法扩增P20基因,扩增出预期525 bp的目的片段.扩增产物克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序.测序结果与参考序列Oregon C24V比较,二者的核苷酸同源性仅为80.95%,推导氨基酸同源性为87.50%.测序结果经NCBI上的Blast(Http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)同源性比较,克隆得到的基因与Osloss株同源性最高,核苷酸同源性为93.65%,推导氨基酸同源性为95.83%.根据P20的测序结果,参照GenBank中BVDV Osloss株设计一对引物,扩增P14基因,经同源性比较,扩增的P14基因与Osloss株核苷酸同源性为94.77%,推导氨基酸同源性为95.10%,通过系统发生分析,推测P20基因和P14基因与Osloss株在进化上比较接近.     

牦牛病毒性黏膜病病毒P125基因的克隆及序列分析

试验参考GenBank中发表的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)毒株基因组序列设计了5对引物,利用PCR扩增出预期的3475 bp目的片段;将扩增产物连接至pMD19-T 载体,经质粒PCR鉴定及双酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行核苷酸序列测定。经BLAST同源性分析表明,牦牛BVDV P125基因与BVDV-Ⅰ型的NADL毒株P125基因的同源性为63.4%。系统分析结果表明,牦牛P125基因与BVDV标准毒株P125基因在遗传进化与亲缘关系上均较远,这可能是因为环境诱变的结果或该毒株具有新的遗传衍化来源。     

牛病毒性腹泻病毒P20及P14蛋白基因的表达及其产物的抗原性分析

将牛病毒性腹泻病毒（bovine viral diarrhea virus，BVDV）p20和p14基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6p-1和pPROEX—HTb，并转化至相应的宿主菌大肠杆菌BL21（DE3）pLysS和DH5α中表达。P20蛋白在2个宿主中都获得了高效表达；P14蛋白在BL21（DE3）pLysS中表达量较低，而在DH5α中未见表达。对P14蛋白诱导表达过程的监测表明，P14蛋白对大肠杆菌是一种毒性蛋白。用Western—blotting分析未能检测到两种蛋白的反应条带，推测这两种蛋白可能存在构象表位。     

牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的真核表达及抗原性检测

为研究牛病毒性腹泻病毒（BVDV）E^rns基因的生物学功能，将含有牛病毒性腹泻病毒E^rns基因的质粒pMD18-T—EE^rns经BamHⅠ／HindⅢ双酶切，获得了E^rns片段，再与杆状病毒转移栽体pBlueBaeHis2A连接，构建成重组质粒。将重组质粒pBlueBaeHis2A-E^rns与Bac-N—Blue^TMDNA共转染至sf9昆虫细胞中，获得了重组病毒，经噬斑筛选纯化，感染sf9昆虫细胞进行表达。SDS-PAGE分析结果表明，表达的目的蛋白大小约30ku；Western-blotting检测表明，该蛋白具有良好的抗原性。     

牛病毒性腹泻病毒长春分离株P125基因的克隆与序列测定

以MDBK细胞培养细胞病变型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）NCD毒株，采用异硫氰酸胍一步法提取总RNA，并根据BVDVNADL参考株序列设计合成的1对引物（W1与W2），进行反转录PCR（RT-PCR），扩增出P125基因约400bp的片段。经PGEM-T载体连接后克隆、测序，并与巳发表的NADL、Osloss、SD-1、184、D、H、Yak等BVDV毒析序列进行比较。结果表明：NCD株P125基因区无插入或缺失变异，但存在着核苷酸的替换；经聚类分析初步认为NCD株属于Ia型。NCD株与长春184、H株核苷酸序列差异较大，而亲缘关系较近，表明BVDV在同一地区存在不同进化来源的毒株。     

牛病毒性腹泻病毒p80基因的分段表达及其抗原性分析

为建立以重组p80蛋白为抗原的牛病毒性腹泻（BVD）鉴别诊断ELISA方法，采用PCR方法克隆了BVDV p80基因的A、B、C三段基因片段，分别连接到原核表达载体pGEX-6P1上，获得了重组质粒pGEX-6PI-p80A、pGEX-6PI-p80B和pGEX-6P1-p80C，将其分别转化感受态茵Rosetta和BL21，经1．0mmol／L的IPTG诱导，分别得到大小为60、47和51ku的目的蛋白。经Western-blotting分析，3个目的蛋白中，只有p80B（289～477aa）基因片段所表达的融合蛋白能与BVDV阳性血清反应，表明p80蛋白的免疫优势区域集中在此部位。该融合蛋白可以作为诊断抗原用于建立ELISA诊断方法。     

牛病毒性腹泻病毒的分子生物学进展

牛病毒性腹泻病毒（ＢＶＤＶ）可引起临床感染和某些疾病,包括繁殖障碍、呼吸综合症、先天性缺陷、肠炎、持续感染（ＰＩ）和粘膜病（ＭＤ）〔１,２〕。本文阐述ＢＶＤＶ的生物学特征、基因组、编码蛋白及ＭＤ致病的分子机制。１ＢＶＤＶ生物学特征１．１ＢＶＤＶ分类位...     

牛病毒性腹泻病毒梅花鹿分离株E0基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术扩增了牛病毒性腹泻病毒(BVDV)梅花鹿分离株E0基因，并将其克隆到pMD18-T克隆载体和pET28a原核表达载体中，构建了pMD18-T／E0和pET28a／E0重组子，并进行了测序和表达。表达产物分别用12％SDS-PAGE检测和牛抗BVDV阳性血清进行Western-blotting检测，结果表明．BVDV梅花鹿分离株E0基因的核苷酸序列与匈牙利VEDEVAC株的同源性高达98．6％，与C21V标准株的同源性为84．9％，证明构建的重组子是正确的；BVDV梅花鹿分离株E0基因得到了正确表达。     

甘肃、青海和宁夏地区牛病毒性腹泻病毒Erns基因的变异分析

分析2013—2019年中国西北部分省区不同基因亚型牛病毒性腹泻病毒（BVDV）抗原基因E^rns的分子特征,了解其遗传演化规律。从甘肃、青海、宁夏规模化牛场送检的疑似牛病毒性腹泻发病牛150份EDTA抗凝血提取总RNA,利用RT-PCR扩增病毒基因组E^rns-E1区,克隆测序后比对,构建系统进化树进行遗传演化关系分析。利用牛肾细胞MDBK对检出的不同基因亚型BVDV进行分离,并鉴定其生物型。RT-PCR扩增结果表明,BVDV总体阳性率为37.33%,其中甘肃省、青海省、宁夏回族自治区BVDV阳性率分别为37.68%、35.71%、40.00%。获得56份E^rns-E1 DNA,克隆测序获得33条不同的E^rns序列,长度均为681 bp,分析表明流行株分属10个BVDV基因亚型：BVDV-1a （2株）、BVDV-1b （5株）、BVDV-1c （1株）、BVDV-1d （3株）、BVDV-1m （11株）、BVDV-1o （1株）、BVDV-1p （4株）、BVDV-1q （4株）、BVDV-1v （1株）、BVDV-2a （1株）。分离获得BVDV-1a亚型、BVDV-1b亚型、BVDV-1v亚型、BVDV-2a亚型分离株各1株,BVDV-1 d亚型分离株2株,均为非致细胞病变型。各亚型株间E^rns基因核苷酸相似性以BVDV-1a～1d经典亚型株（79.8%～85.9%）或1m～1q及1v新亚型株（81.0%～87.3%）较高,以BVDV-1 m和BVDV-1p流行株亚型间相似性最高（87.3%）。各亚型株E^rns基因编码蛋白的RNA酶活性位点以及双链RNA作用基序（₁₃₉KKGK₁₄₂）保守,但E^rns第26位糖基化位点（26 NRSL）在1m～1q、1v亚型株移位（24 NVSR）。首次以E^rns核苷酸序列构建系统进化树,结果显示1m～1q及1v等亚型BVDV株在进化上关系较为密切。本研究首次选用E^rns靶标基因对甘肃、青海、宁夏部分省区牛源BVDV株进行同源性及系统进化分析,发现10个基因亚型流行株,以1m亚型株最为普遍,1m～1q及1v等亚型株亲缘关系密切。     

牛病毒性腹泻病毒致病机理研究进展

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）是危害养牛业的重要病原之一。BVDV感染能够引起广泛的临床症状，包括牛病毒性腹泻、粘膜病、持续感染与免疫耐受、繁殖障碍、血小板减少与出血综合征等，其相应的致病机理也非常复杂。持续感染是妊娠母畜在怀孕早期通过子宫内感染非致细胞病变（NCP)型BVDV引起的，是BVDV在自然环境中维持存在的一种重要形式。当持续感染动物再次感染抗原性相似或同源的致细胞病变（CP）型病毒时就会发生粘膜病。本文将粘膜病发生过程中CP型病毒的来源机制概括为五点：①外源细胞序列的插入；②病毒基因的重排和拷贝；③外源细胞序列插入同时伴有病毒基因的复制；④缺陷干扰粒子；⑤点突变。BVDV感染导致奶牛繁殖力下降的机制可能有两条：一是造成卵母细胞的质量下降，二是使性腺类固醇激素生成机制受到破坏，导致血浆中雌二醇、黄体酮等激素紊乱。血小板减少和出血性综合征是BVDV感染引起的又一重要临床症状，其致病机理主要有两种：①BVDV进入到外周循环，使外周循环中血小板受损程度增加，病理检查表现为血小板体积平均值较正常有明显增大；②BVDV感染造成骨髓生成血小板的能力下降，病理检查表现为血小板的体积平均值较正常减少。     

牛传染性鼻气管炎弱毒与牛病毒性腹泻弱毒抗原免疫干扰的研究

本试验使用3~6月龄健康易感牛9头(牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体均阴性),共分3组,每组3头犊牛。第1组首免肌肉注射IBRV-LNM弱毒疫苗株种毒,接种1周后,每头牛接种BVDV-SM弱毒疫苗株;第2组只接种BVDV-SM弱毒疫苗株种毒,接种时间同第1组;第3组为对照组,接种MDBK细胞培养液。接种BVDV-SM疫苗毒后每周采血至疫苗毒接种后28 d,测定接种后BVDV抗体效价,并采用BVDV-JL检验用强毒进行攻毒试验。结果表明,第1组与第2组试验动物血清中牛病毒性腹泻病毒抗体水平无明显差异,能够抵抗BVDV-JL强毒攻击达到免疫保护的效果,说明牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-LNM弱毒疫苗株接种后在牛体内对牛病毒性腹泻病毒BVDV-SM疫苗毒不产生免疫干扰作用。     

牛轮状病毒与病毒性腹泻病毒的双重RT-PCR检测方法的建立

建立了能够同时检测牛轮状病毒（BRV）与牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的双重RT-PCR方法。应用两对特异性引物进行了双重RT-PCR扩增,这两对引物分别对应于BRV的VP7基因和BVDV的5-UTR中的部分编码序列,其扩增产物分别为342bp和196bp。说明该方法的特异性强、敏感性高,可检测到1pg的病毒RNA,可应用于临床诊断和流行病学研究。     

牛病毒性腹泻病毒侵染细胞机制的研究进展

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是反刍动物和猪体内广泛存在的危害动物健康的重要病原体.BVDV感染牛后主要引起牛的持续性感染、免疫耐受、免疫抑制、繁殖障碍及急慢性黏膜病等临床症状,给养牛业造成重大的损失.其致病机理非常复杂,给该病的治疗和根除带来极大的困难.随着分子病毒学研究的发展以及对猪瘟病毒和黄病毒科其他成员的研究,人们在BVDV分子水平和细胞水平的研究方面也取得了一些进展.就此,作者从BVDV入侵细胞、在细胞内的复制以及与宿主蛋白分子相互作用等方面进行综述,有助于阐明BVDV致病和在体内持续存活的机制,为该病的防治和疫苗研发提供新的思路和对策.     

牦牛病毒性腹泻病毒E1基因的克隆及生物信息学分析

参考GenBank中发表的BVDV毒株的基因组序列设计2对引物,利用套式RT-PCR方法首次成功克隆牦牛体内分离鉴定出的牛病毒性腹泻病毒E1基因,并扩增出预期的585 bp目的片段。将扩增产物克隆至pMD18-T Vector,经质粒PCR鉴定及酶切鉴定获得阳性重组质粒并进行测序。测序结果经BLAST同源性比较分析,克隆得到的E1基因与Osloss株同源性最高,但核苷酸同源性仅为73.3%,推导氨基酸同源性仅为82.6%,表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变。这可能是该病毒为适应牦牛这种特有生物体和牦牛所生活的高原生态环境的结果,或该病毒也可能具有独立的遗传衍化来源。     

牦牛病毒性腹泻病病毒E2基因的克隆及序列分析

根据GenBank中已发表的多株牛病毒性腹泻病毒的E2基因序列比较分析设计了3对引物,应用RT-PCR方法首次扩增出牦牛病毒性腹泻病毒的E2基因区637 bp的片段序列,经pMD18-T载体连接后克隆、测序,并与已发表的NADL、Osloss、Oregon C24V等毒株E2基因序列进行系统发育进化树比对分析,结果表明,牦牛病毒性腹泻病毒的E2基因无插入或缺失,系统发育进化分析表明,与其他毒株核苷酸同源性较低,最高仅为68.8%,推导氨基酸序列为68.4%。较低的同源性表明牦牛病毒性腹泻病毒存在较大的基因突变或者可能还具有独立的衍化来源。     

牛病毒性腹泻病毒间接ELISA方法的建立

持续性感染和免疫耐受是牛病毒性腹泻病的重要特征,也是该病的防控难点.本试验将2种生物型的牛病毒性腹泻病毒(BVDV):致细胞病变(CP)型(BVDV OregonC24株)和非致细胞病变(NCP)型(BVDV Yak株),灭活、浓缩作为抗原,分别免疫家兔制备高免血清.同时,使用BVDV全病毒蛋白作为包被原,建立了检测BVDV的间接ELISA检测方法.本试验利用该方法对高免血清进行检测,探讨CP型BVDV与NCP型BVDV抗原免疫原性差异.结果显示,CP型BVDV的高免血清效价均比NCP型BVDV高免血清的效价高,平均高35%.结果表明,CP型BVDV的免疫原性优于NCP型BVDV,且CP型BVDV与NCP型BVDV的血清效价具有明显差异.这为在实践中疫苗毒株筛选及生产提供了理论指导.     

鉴别牛病毒性腹泻病毒和猪瘟病毒的复合PCR方法及其应用

以牛病毒性腹泻病毒 (BVDV)特异引物 P1/ P3扩增 BVDV标准毒株及以猪瘟病毒 (HCV)特异引物 P2 / P3扩增HCV阳性病料 ,分别扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的特异片段 ;以 P1、P2、P3扩增 BVDV和 HCV人工混合感染样品 ,扩增出大小为 32 6 bp和 2 5 2 bp的 2条片段 ,建立了特异的一步检测 BVDV和 HCV的复合 PCR方法。以建立的复合 PCR方法检测 BVDV分离株 ,都扩增出 1条 32 6 bp的特异片段 ;从吉林等地送检的病料和猪瘟兔化弱毒疫苗中扩增出一2 5 2 bp的特异片段 ,从长岭地区的疑似猪瘟病猪的血清病料中 ,同时扩增出 32 6 bp和 2 5 2 bp的核酸片段 ,表明长岭某猪场流行的“猪瘟”为 BVDV和 HCV混合感染。本研究为进行 HCV和 BVDV的鉴别诊断与流行病学调查提供了有效的方法。