鳜弹状病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为建立快速、准确检测鳜弹状病毒(SCRV)的TaqMan荧光定量PCR方法,本实验根据弹状病毒N基因中的保守序列,设计合成了一对特异性引物和TaqMan探针,以构建的标准质粒为模板,经条件优化后建立了SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行试验。结果显示,建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法标准曲线的相关系数为0.999,质粒标准品在1×10~8拷贝/μL～1×10~1拷贝/μL范围内有较好的线性关系;该方法可以特异性检测SCRV,但对草鱼出血病病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)、石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、传染性脾肾坏死病(ISKNV)、神经坏死病毒(NNV)及鲤春病毒血症病毒(SVCV)等7种常见鱼类病毒检测结果均为阴性;最低可检测到的质粒标准品浓度为102拷贝/μL,比常规PCR方法灵敏100倍;该方法组内与组间变异系数均小于2%。采用该方法对35份临床样品进行检测,结果显示阳性检出率为31%,而普通PCR阳性检出率为14%,该方法检出率比常规PCR高。本研究建立的SCRV的TaqMan荧光定量PCR检测方法为SCRV的快速检测提供了可行的技术手段。     

布鲁氏菌实时定量荧光PCR检测体系的建立及应用

本根据GenBank上公布的布鲁氏菌BCSP31基因保守区域序列设计合成一对特异性引物与TapMan探针,建立整套快速准确鉴定布鲁氏菌的实时定量荧光PCR检测体系。以实验室构建的克隆有布鲁氏菌目的片段的重组质粒为标准品,进行实时定量荧光PCR反应检测,通过优化反应条件,建立标准曲线。以标准品为模板,对该方法的特异性、敏感性与重复性进行检测与分析。并以临床样本进行检测的结果进行比较分析,结果表明,该检测体系的检测灵敏度高,重复性与特异性良好。本研究建立的实时定量荧光PCR可用于准确检测样本中的少量的布鲁氏菌,具有良好的应用前景和市场价值。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列,设计了一对特异性引物和探针,使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法。结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性。     

副猪嗜血杆菌荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立基于SYBR Green Ⅰ的快速检测副猪嗜血杆菌(HPS)的实时荧光定量PCR方法,参照GenBank公布的HPS的infB基因序列(DQ:781933.1),设计特异性引物;提取HPS基因组,进行PCR扩增,回收目的片段;构建阳性标准模板,建立标准曲线;验证其敏感性、重复性和特异性。结果显示,本试验得到了阳性标准质粒,并建立了标准曲线,线性关系在102copies/μL～108copies/μL检测范围内良好;该方法敏感性达到10copies/μL,比常规PCR高100倍,重复性试验变异系数均小于2.5%,同时对HPS具有良好的特异性。结果表明,本试验建立的副猪嗜血杆菌SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法可用于临床对HPS的快速诊断和定量检测。     

火鸡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

针对火鸡疱疹病毒(HVT)特异性的sorf1区基因序列设计引物,建立检测HVT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r2=0.99),熔解曲线分析显示该PCR扩增具有良好的特异性、敏感性和重复性,试验表明该方法最低检测浓度为7×101拷贝/μL。利用该方法对野生型HVT和rHVT-pmpD-N在体内和体外的复制特性进行检测,结果表明重组后的HVT与野生型HVT的增殖速度基本一致。本试验建立的检测方法能够快速检测HVT,准确率高,特异性好,具有较高的灵敏度和稳定性,为监测HVT体内和体外的病毒含量和复制情况提供了一种有效的手段。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为了研究检测非洲猪瘟病毒的方法,试验采用GenBank公布的非洲猪瘟病毒(ASFV)P72基因序列设计了1对特异性引物和探针,并使用含有选定检测序列的重组质粒标准品绘制标准曲线,建立了非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法.结果表明:该方法的敏感性可达100个拷贝值,具有良好的敏感性和重复性.     

鸡Caspase-1基因SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立快速定量检测鸡Caspase-1基因的方法,本研究根据鸡Caspase-1基因序列设计特异性检测引物,PCR扩增Caspase-1基因片段,构建pMD-Caspase-1重组质粒。以该重组质粒为标准品进行荧光定量PCR扩增,建立标准曲线,并通过反应条件优化、特异性、敏感性及重复性等试验,建立了鸡Caspase-1基因SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。结果显示,本研究建立的该荧光定量PCR方法在重组质粒标准品为1.0×10~3拷贝/μL～1.0×10~8拷贝/μL范围内具有良好的线性关系;该荧光定量PCR方法对Caspase-1基因的扩增具有较强的特异性;对重组质粒标准品的检测下限为1.0×10~2拷贝/μL,比常规PCR敏感100倍;批内和批间变异系数分别在0.51%～4.41%和0.37%～0.88%,重复性好。利用所建立的方法可以定量检测致病性禽腺病毒血清4型感染鸡不同组织中Caspase-1的转录水平。本研究方法的建立将为研究鸡Caspase-1在免疫反应和疫病发展过程中的作用提供技术支持。     

鸡减蛋综合征病毒Hexon基因SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立

用PCR方法扩增出鸡减蛋综合征病毒（EDSV）Hexon基因保守片段,经琼脂糖凝胶电泳及序列测定分析扩增产物的特异性。以构建的阳性重组质粒作为标准品,建立SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR反应的扩增曲线和溶解曲线,并绘制标准曲线。结果表明,建立的EDSV荧光定量PCR标准曲线Ct值与1×10^1～1×10^6拷贝/μL的基因拷贝数呈现良好线性关系,灵敏度可达10拷贝,且特异性及重复性良好;说明本试验建立的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法可用于EDSV的诊断及病原的定量分析。     

猪源牛病毒性腹泻病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种荧光定量PCR检测方法,用于猪源牛病毒性腹泻病毒(BVDVs)检测,同时能鉴别诊断猪瘟病毒(CSFV).根据BVDVs与CSFV 5 '-UTR保守序列,设计一套引物和特异TaqMan探针,以本实验室构建的猪源BVDVs 5′-UTR阳性重组质粒为标准品,通过优化反应条件,建立了标准曲线.以构建的标准品为模板进行了特异性、敏感性、重复性试验、并应用于临床检测.结果显示,该方法检测CSFV、猪繁殖与呼吸综合征病毒均为阴性;最低可检测到每个反应相当于10拷贝的标准品DNA;重复性试验的批内变异系数为0.20％～0.95％;应用所建立方法对临床样品进行检测,其结果与普通RT-PCR结果的符合率为86.7％.本研究建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、重复性好等优点,可用于猪感染BVDVs、猪瘟疫苗污染BVDVs的监测.     

牛病毒性腹泻病毒SYBR Green荧光定量PCR方法的建立及其应用

为了建立BVDV快速诊断方法,针对BVDV基因组5’UTR序列保守区域设计了荧光定量PCR引物,并建立了快速检测BVDV的荧光定量PCR方法。结果表明,以构建的重组质粒pMD-5’UTR为标准品建立的SYBR Green荧光定量PCR方法标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.997 3;敏感性试验结果显示,该方法敏感性较好,其最低检测下限为10拷贝。重复性试验结果显示,该方法批内和批间的变异系数为均小于5%,表明该方法的重复性良好。特异性试验显示,该方法与牛副流感病毒3型、牛传染性鼻气管炎病毒不存在交叉反应,但其不可区别鉴定BVDV与猪瘟病毒。应用所建立的SYBR Green荧光定量PCR方法测定非致细胞病变型BVDV(BVDV-BJ-2016株)分离毒株的一步生长曲线,发现在感染后12～48 h为其对数生长期。该研究为研究非致细胞病变型生长特性提供了参考。     

鉴别高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒二重实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

据GenBank登录的高、低致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒（highly and lowly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus,HP/LP-PRRSV）的非结构蛋白2（Nsp2）基因序列设计特异性引物和TaqMan MGB荧光探针,经优化反应条件,建立鉴别HP/LP-PRRSV二重TaqMan MGB实时荧光定量RT-PCR（Real-time fluorescent quantitative RT-PCR）检测方法;对该二重实时荧光定量RT-PCR方法进行了敏感性、特异性和重复性试验;对疑似PRRSV感染临床样品进行了应用检测,同时与建立的HP/LP-PRRSV二重RT-PCR方法进行了对比试验。结果显示,成功建立了鉴别HP/LP-PRRSV的二重实时荧光定量RT-PCR检测方法,HP/LP-PRRSV标准曲线的循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,相关系数分别为0.998和0.997;该方法灵敏度可达10¹拷贝/μL;特异性高,对HP/LP-PRRSV阳性对照扩增呈阳性反应,而对5个对照病原均呈阴性反应;不同浓度的HP/LP-PRRSV重组质粒分别重复扩增3次,重复结果良好;对25份临床疑似PRRSV感染样品进行了应用检测,阳性检出率为92%,较普通二重RT-PCR方法阳性检出率高。     

鉴别非洲猪瘟病毒和猪瘟病毒野毒株二重TaqMan MGB实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

旨在建立特异、敏感的实时荧光定量PCR（FQ-PCR）方法,用于非洲猪瘟病毒（ASFV）和猪瘟病毒（CSFV）野毒株的快速鉴别检测。针对ASFV的P72基因和CSFV野毒株的5'UTR非编码区序列的保守区域分别设计1对特异性引物和1条探针,经优化反应条件,建立一种基于TaqMan MGB探针技术的FQ-PCR方法,验证方法的敏感性、特异性和稳定性,对50份临床样品进行检测,并与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法进行比较分析。结果显示：建立的鉴别ASFV和CSFV野毒株二重FQ-PCR检测方法在10⁰~10⁶拷贝·μL^-1模板范围内有良好的线性关系;对ASFV和CSFV基因出现阳性扩增信号,但对猪瘟病毒疫苗株、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪乙型脑炎病毒、副猪嗜血杆菌等病原对照未出现扩增;批内、批间试验变异系数在1.18%~2.08%,重复性良好;对ASFV和CSFV的最低检测模板浓度均为10拷贝·μL^-1;利用建立的二重FQ-PCR方法对50份临床样品进行检测,检测结果与猪瘟国标方法及OIE推荐的非洲猪瘟检测方法结果完全一致。本研究成功建立了鉴别ASFV和CSFV野毒株二重TaqMan MGB FQ-PCR方法,为ASFV和CSFV野毒株的鉴别诊断提供了快速、敏感、特异且能满足临床检测需求的检测方法。     

实时荧光定量PCR检测鸡生长激素基因方法的建立

本研究旨在建立定量分析鸡生长激素(Growth hormone,GH)基因mRNA表达水平的实时荧光定量PCR方法,为鸡GH基因mRNA表达水平的定量分析及探讨其与马立克氏病遗传抗性间关系奠定基础。根据GenBank数据库中鸡的GH基因序列,使用Oligo7软件在该基因保守区域设计合成一对引物并扩增GH基因片段,经回收纯化后连接到pGM-T载体,成功构建了含有GH基因片段的pGM-T-GH标准质粒。在此基础上,通过SYBR GreenⅠ染料法建立了pGM-T-GH重组质粒的实时荧光定量PCR标准曲线及其回归方程,成功建立了实时荧光定量PCR检测鸡GH基因的方法。     

检测伪狂犬病毒gB基因荧光定量PCR方法的建立

利用DNAMAN软件对GenBank登录的伪狂犬病病毒（PRV）各毒株gB基因序列进行比对分析,选择其保守区域设计合成特异性的引物和TaqMan探针,同时利用普通PCR技术扩增获得全长的伪狂犬病毒gB基因,并克隆到pMD20-T载体上作为阳性标准品。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了一种快速检测伪狂犬病病毒的荧光定量PCR技术。该检测技术具有较高的灵敏性、特异性和可靠性。对制备的pMD-gB阳性标准品的检测结果表明,所建立的伪狂犬病毒TaqMan荧光定量PCR最低检测极限可达1.50×102拷贝/反应;同时相比于普通PCR方法其灵敏度高100～1 000倍以上,并且重复性好。在对60份临床样品的检测中,荧光定量PCR不仅检出了普通PCR检测为阳性的样品,且检出了2份普通PCR未检出的样品,进一步证实了该方法快速、灵敏性好,可用于PRV感染的早期快速定量检测和肉类食品进出口检疫。     

猪嗜血支原体PCR及荧光定量PCR检测方法的建立和比较

为了解猪嗜血支原体(Mycoplasma haemosuis)对猪群的感染情况并建立该病的检测方法,本研究根据GenBank登录的M.haemosuis 16S rRNA基因序列(FJ263944)设计合成PCR引物以及荧光定量PCR(FQ-PCR)引物和探针.以含16S rRNA基因的重组质粒为模板,通过对PCR反应...     

应用双重实时荧光定量PCR方法检测鸡马立克氏病血清1型病毒

本研究建立了鸡马立克氏病血清1型病毒（MDV1）绝对定量检测方法。研究中选择MDV1特有的Meq基因的一段保守序列作为检测对象，将其克隆到质粒载体中，作为阳性标准品；同时将管家基因．鸡卵铁转蛋白（Ovo）特异性基因片段克隆到质粒载体上作为内参照的标准品。经荧光定量PCR（FQ-PCR）法扩增获得MDV1的FQ-PCR两条标准曲线，建立了MDV1双重FQ-PCR检测方法。应用该方法绝对定量检测了实验攻毒鸡及吉林省某地发病鸡只的羽髓、淋巴细胞等组织样本中单位细胞病毒拷贝数，并与琼脂扩散（AGP）、常规PCR等检测方法进行比较。结果表明，不论实验攻毒鸡还是自然发病鸡，羽髓中病毒富含量均高于其它组织，每百万宿主细胞内病毒含量为10^7～10^8拷贝；FQ-PCR检测MD发病鸡只的阳性率高于AGP，达100％；该方法的灵敏度比常规PCR检测高10～100倍，在单位细胞内可灵敏地检测到2．78个拷贝的病毒。该方法可以在不同的样品中有效的绝对定量检测MDVl。     

应用实时荧光定量RT-PCR检测猪HEV ORF2基因3个连续片段的真核表达水平

将构建的猪戊型肝炎病毒广西株3个连续ORF2基因片段重组真核表达质粒pEASY-LB1、pEASY-LB2、pEASY-LB3转染人肾上皮细胞系293T,应用实时荧光定量RT-PCR检测目的基因LB1、LB2、LB3。经ABI7500系统建立的标准曲线相关系数（R2）范围为0.994 209-0.999 130,斜率范围-3.469 403-3.579 107,扩增效率范围为90.28%94.19%。经对转染细胞、空白对照细胞的目的基因、内参基因的扩增曲线和融解曲线分析,表明该实时荧光定量PCR扩增体系的特异性良好,通过2-ΔΔCt相对定量法计算,可得出转染细胞293T-a、293T-b、293Tc目的基因LB1、LB2、LB3的基因表达量分别为6 226 830.88±826 430.14、9 449 238.68±926 057.13、35 177 915.63±3 949 173.42。本实验室建立的3个重组真核表达质粒在293T细胞中的转染成功为深入研究猪戊型肝炎基因工程疫苗奠定了基础。     

奶牛ACC基因SYBRGreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

乙酰辅酶A羧化酶(ACC)在奶牛肝脏中脂肪酸的合成及氧化代谢过程中起着关键作用,ACC mRNA的表达水平对于研究奶牛酮病、脂肪肝等物质代谢障碍性疾病具有重要意义。研究采用双标准曲线法,成功建立了奶牛ACC基因荧光定量检测方法。结果表明,建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法具有操作简便、特异性强、定量准确等优点,为进一步对ACC基因定量分析,研究其在奶牛酮病、脂肪肝等营养代谢性疾病中的作用奠定了基础。     

不同品种猪肠道拟杆菌属-普雷沃氏菌属群实时荧光定量分析

对猪肠道30种细菌的16SrDNA序列进行比对分析,设计拟杆菌属-普雷沃氏菌属荧光定量的特异引物。以多形拟杆菌菌株(CDC1404-A)基因组的DNA为模板,以常规PCR引物扩增16SrDNA靶片断,将PCR产物纯化后作为DNA标准品,将梯度稀释的标准品作模板,建立定量标准曲线。以TaqMan探针建立25μL反应体系,对不同浓度的多形拟杆菌DNA样品进行检测,并以乳酸杆菌、大肠杆菌和双歧杆菌的基因组DNA模板作阴性对照,验证此方法检测拟杆菌属-普雷沃氏菌属的特异性。结果表明:设计的荧光定量引物和探针,仅对拟杆菌和普雷沃氏菌有很强的特异性,该方法的灵敏度可3.73个/μL的基因组DNA。将PCR方法用于5月龄长白和太湖猪回肠内容物检测,其拟杆菌属-普雷沃氏菌属的检测结果呈阳性,每克回肠内容物拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量的拷贝数对数值太湖猪比长白猪高38.5%(P<0.10),而且发现拟杆菌属-普雷沃氏菌属数量与背膘厚度、脂肪率之间有正相关关系。     

Establishment and Application of TaqMan MGB Fluorescent-Quantitative PCR Assay for Detection of Canine Parvovirus

In order to establish a TaqMan MGB fluorescent-quantitative PCR (FQ-PCR) assay for detecting canine parvovirus (CPV) specifically, sensitively and rapidly, a highly sensitive and specific TaqMan MGB FQ-PCR assay was developed using the specific primers and TaqMan MGB probe designed basing on the conservative sequences of VP2 gene of CPV in GenBank. The sensitivity, specificity and repetition assay of FQ-PCR assay were tested, and 46 clinic suspicious CPV infected samples were detected by the FQ-PCR assay in contrast to the routine PCR method. The results indicated that the FQ-PCR was successfully established. The developed FQ-PCR assay was able to detect as little as 1×10¹copies/μL of recombinant pGEX-T/CPV plasmid DNA, and the sensitivity of which was 100 times more than that of the routine PCR. The specificity assay exhibited that positive signals could be obtained from recombinant pGEM-T/CPV plasmid, but not from the genomic DNA or total cDNA of the other 5 kinds of pathogenic microorganism acting as the controls. The repetition tests were carried out by detection repeated 3 times for 3 different concentrations of recombinant pGEX-T/CPV plasmid, and the results indicated that the FQ-PCR was reproducible. Twenty-three positive results from 46 clinic suspicious CPV infected samples were obtained, which showed the better sensitivity than that of the routine PCR, with 19 positive samples from the same 46 suspected samples. The study suggested that the CPV FQ-PCR method was successfully established, and suitable for clinic rapid diagnosing of CPV and early detection of latent infection.