犬瘟热疫苗研究进展

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)感染犬和其他食肉动物引起的一种病死率高的接触性传染病。近年来暴发了多起犬和野生动物自然感染犬瘟热病毒的案例。目前尚无治疗犬瘟热的有效药物或生物制剂。犬瘟热的预防主要依靠接种疫苗,应用最为广泛的是弱毒活疫苗,但也存在一些问题。论文主要概述了犬瘟热弱毒活疫苗、基因疫苗、病毒载体疫苗的研究进展,以期为研制安全、高效的犬瘟热新疫苗提供参考。     

犬瘟热诊断和防制研究进展

犬瘟热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)引起的一种世界性分布的传染病,对我国的各种犬及貂、狐等毛皮动物养殖业的发展危害最大。犬瘟热病毒(CDV)属于副粘病毒科,麻疹病毒属。CDV基因组为单股负链RNA,大小约15Kb,由7个基因构成,编码顺序为3核蛋白(N)-磷酸化蛋白(P)—基质蛋白(F)—血凝素(H)—大蛋白(L)——5’,此外还有一个C蛋白基因。犬瘟热作为犬的重要传染病,可表现为多种复杂症状,由于其典型的双相热型在近期的临床病例中并不常见,致使临床确诊较为困难。因此,实验室诊断CDV是非常必要的。目前对于控制犬瘟热的有效方法是疫苗接种,而大规模使用的疫苗是弱活毒疫苗。弱毒疫苗对犬瘟热的预防起到了一定的作用,在很大程度上控制了犬瘟热的发生,但是近年来CDV疫苗免疫存在失败现象。本文就近年来犬瘟热的诊断和防制方面作一综述。     

免疫用生物制品的合理应用

一、犬免疫用生物制品的种类及用法 常见的犬用疫苗有：犬五联弱毒苗、六联弱毒苗、七联弱毒苗。五联弱毒苗用于预防犬瘟热、犬细小病毒性肠炎、犬传染性肝炎、犬副流感和狂犬病。六联弱毒苗较五联弱毒苗的免疫范围增加了犬轮状病毒性肠炎。七联弱毒苗较六联弱毒苗防疫范围增加了犬钩端螺旋体病。三种疫苗均只可注射健康犬。用法为：断奶仔犬间隔2～3周，连续接种2～3次，每次肌注一个剂量，以后每年加强免疫1～2次。犬用灭活菌苗有犬传染性肝炎灭活苗和犬细小病毒灭活苗，因灭活苗的免疫效果不如弱毒苗，近几年在犬免疫接种中用的较少。     

犬瘟热新型疫苗研究进展

犬疸热(CD)是由犬瘟热病毒(CDV)感染引起的犬及其他肉食动物的一种急性或亚急性、高度接触性传染病.近年来虽广泛应用弱毒疫苗预防CD,但世界各地仍有犬及野生动物感染CDV并造成CD流行的报道.随着分子生物学技术的深入发展,国内外学者应用基因工程技术对犬瘟热预防进行了深入研究,并取得了丰富的研究成果.笔者对近几年来犬瘟...     

表达犬瘟热病毒H基因重组新城疫病毒的构建及其免疫原性研究

为研制安全、有效的新型犬瘟热疫苗,本研究利用新城疫病毒(NDV) LaSota弱毒疫苗株反向遗传操作系统,构建出表达犬瘟热病毒(CDV)弱毒疫苗株Rockborn-20/8血凝素(H)蛋白的重组病毒rLa-CDV-H,并对其生物学特性进行鉴定,评估其作为犬瘟热活载体疫苗的安全性和有效性.通过免疫荧光和western blot试验证明了CDV H蛋白的正确表达;重组病毒株保持了LaSota亲本株的低致病性和高滴度鸡胚生长特性;重组病毒rLa-CDV-H接种12周龄比格犬后,可以诱导显著的CDV中和抗体反应.本研究表明重组病毒rLa-CDV-H具有作为犬瘟热重组病毒活载体疫苗的潜力.     

检测和鉴别犬瘟热病毒强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应(RT-nPCR)的建立及初步应用

根据GenBank上登录的犬瘟热病毒（Canine distemper virus，CDV）基因组全序列，选择CDV强、弱毒株间有区别保守区设计了一对通用引物P1和P4，并在该对引物跨越区域的内部设计了CDV强毒株特异性引物P2及弱毒株特异性引物P3，用引物P1／P4进行RT—PCR，然后用引物P2／P3／P4进行复合套式PCR，建立了一种能区分CDV强、弱毒株的复合反转录-套式聚合酶链式反应（RT—nPCR）的鉴别诊断方法。应用该方法从CDV强、弱毒株的基因组中分别扩增出了大小为247bp和177bp的特异性片段，从两种病毒基因组混合物中扩增出了大小为247bp和177bp的两条特异性片段，与犬细小病毒、犬腺病毒、犬冠状病毒、狂犬病病毒、新城疫病毒的细胞培养物以及正常细胞对照组进行复合RT—nPCR扩增时均为阴性。对从黑龙江省和吉林省采集的20份疑似CDV病料进行的检测结果表明，有15份类似CDV强毒，5份类似CDV弱毒。本研究建立的复合RT—nPCR可以有效检测CDV感染，能够将强、弱毒株区分开，可用于临床快速检测、流行病学监测以及追踪疫苗免疫效果等。     

基于H蛋白基因的犬瘟热病毒遗传变异分析

犬瘟热是犬瘟热病毒(Canine distemper virus,CDV)感染犬和其他食肉动物造成的多发性、致死性传染病,本文从分子水平上探讨CDV遗传进化特性、变异情况与流行规律之间的关系.通过收集2002-2010年在中国地区分离的14株CDV野毒株、2006-2007年在全球各地分离的12株CDV野毒株以及从不同宿主分离的12株CDV野毒株和4株疫苗株,将其分为4组,将前3组野毒株分别与国内外正在使用的4株疫苗株的H基因进行遗传变异分析.分析发现,CDV野毒株与疫苗株间H蛋白基因的核苷酸相似性为86.2％～92.1％,其氨基酸相似性为89.1％～91.9％;H基因的584位的天冬酰胺糖基化位点是Asia-Ⅰ型CDV所特有的;H蛋白3555区域的非同义氨基酸替换概率较高.作者推测H蛋白抗原变异可能造成弱毒疫苗免疫效力降低,不能为某些CDV株的感染提供完全有效的保护.     

非典型犬瘟热病毒部分序列的测定及比较分析

犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）引起的急性、高度接触性和传染性极强的病毒病，不同年龄、不同性别、不同品种的犬均可感染，幼龄动物多为急性、致死性经过，成年动物可呈慢性持续性感染。近年来，我国不同区域不论犬或野生动物均有CD疫情爆发，而且临床还出现了表现非典型犬瘟热临床症状的病犬，亟需证实犬群中是否出现了CDV强毒变异株，因此笔者对门诊病料进行了分离鉴定及核酸序列的比较分析，现报道如下。     

犬瘟热的流行及发病特点

犬瘟热（CD）是由犬瘟热病毒（CDV）感染引起的急性、高度接触性传染病。犬瘟热病毒在分类上属于副粘病毒科,是单股的RNA病毒,外面有一脂蛋白囊膜。犬瘟热病毒的自然宿主是犬科动物和鼬科动物。感染犬临床表现为呼吸道和消化道症状,也常见神经症状。本病在世界范围内流行，是当前世界养犬业乃至毛皮动物养殖业和野生动物保护方面危害最大的疾病之一。     

圈养大熊猫麻疹病毒易感性流行病学调查

成都大熊猫繁育研究基地对圈养的7只8～21岁的大熊猫血清犬瘟热病毒(CDV)中和抗体滴度进行了测定.结果显示,尽管这些大熊猫自2003年起每年接受2次CDV弱毒疫苗接种,该弱毒疫苗是由未知家犬犬瘟热病毒株制作的,大熊猫血清犬瘟热病毒中和抗体滴度却在2×到256×的较大范围内(平价值=16)波动.通常单次的麻疹病毒弱毒疫苗注射足以导致宿主产生相应的稳定的免疫反应,在大熊猫上抗犬瘟热中和抗体变化幅度较大提示在宿主与疫苗的关系中存在某种程度的不足.     

Post-vaccinal distemper encephalitis in two Border Collie cross littermates

Abstract

CASE HISTORY: One 4.5-month-old male Border Collie cross presented with aggression and seizures in October 2006. A 16-month-old, female, spayed Border Collie cross presented with hypersalivation and a dropped jaw and rapidly became stuporous in September 2007. The dogs were littermates and developed acute neurological signs 5 and 27 days, respectively, after vaccination with different modified live vaccines containing canine distemper virus.

HISTOPATHOLOGICAL FINDINGS: Sections of brain in both dogs showed evidence of encephalitis mainly centred on the grey matter of brainstem nuclei, where there was extensive and intense parenchymal and perivascular infiltration of histiocytes and lymphocytes. Intra-nuclear and intra-cytoplasmic inclusions typical of distemper were plentiful and there was abundant labelling for canine distemper virus using immunohistochemistry.

DIAGNOSIS: Post-vaccinal canine distemper.

CLINCIAL RELEVANCE: Post-vaccinal canine distemper has mainly been attributed to virulent vaccine virus, but it may also occur in dogs whose immunologic nature makes them susceptible to disease induced by a modified-live vaccine virus that is safe and protective for most dogs.     

Canine distemper virus infection of canine footpad epidermis

Infection of the footpad epidermis can occur in natural canine distemper virus (CDV) infection of dogs. Footpads from 19 dogs experimentally inoculated with virulent distemper strain A75/17 and from two nonexposed dogs were examined histopathologically and assessed for the presence of viral antigen and nucleoprotein mRNA, as well as number of inflammatory and apoptotic cells. Dogs were divided into four groups based on inoculation status and postmortem examination: inoculated dogs with severe distemper (group 1, n = 7); inoculated dogs with mild distemper (group 2, n = 4); inoculated dogs without distemper (group 3, n = 8); and noninoculated dogs (group 4, n = 2). Footpads from dogs of all groups had a comparably thick epidermis. Eosinophilic viral inclusions and syncytial cells were present in footpad epidermis of one dog of group 1. Footpads of group 1 dogs contained viral antigen and mRNA in the epidermis with strongest staining in a subcorneal location. Additionally, in these dogs footpad dermal structures including eccrine glands and vascular walls were positive for virus particles. No CDV antigen or mRNA was present in the footpad epidermis and dermis of any other dog. Group 1 dogs had more CD3-positive cells and apoptotic cells within the basal layer of the epidermis when compared to the other groups. These findings demonstrate that in experimental infection CDV antigen and mRNA were colocalized in all layers of the infected canine footpad epidermis. The scarcity of overt pathological reactions with absence of keratinocyte degeneration indicates a noncytocidal persisting infection of footpad keratinocytes by CDV.     

区分犬瘟热病毒Asia-Ⅰ型野毒株及疫苗株的AS-PCR方法

犬瘟热是一种接触性传染病,可侵害免疫系统、呼吸系统、消化系统,甚至神经系统,导致全身性的病理变化,对宠物犬、毛皮动物等存在巨大威胁。目前常用的胶体金检测法不能有效区分疫苗免疫与动物自然感染。为建立一种高效准确的鉴别犬瘟热病毒野毒株和疫苗株的检测方法,本试验对从武汉地区收集已确诊犬瘟热的6只犬分离得到的野毒株以及3株广泛使用的CDV疫苗株进行全基因组测序,从氨基酸水平和碱基水平比对分析后,确定H基因为AS-PCR引物设计的靶基因。通过对H基因进行分型,发现武汉地区流行的CDV均为Asia-Ⅰ型,而疫苗株Y2为America-I型,疫苗株Y1和Y3均为America-Ⅱ型。对比179株Asia-Ⅰ型（6株野毒株样品+173株GenBank Asia-Ⅰ型）与3株疫苗株的CDV-H基因序列,采用AS-PCR技术（3'端错配）设计出1对能有效区分犬瘟热Asia-Ⅰ型野毒株和疫苗株的特异性引物,上游引物序列为5'-TTAAATGATAATGACATAGTG-3',下游引物序列为5'-CCTGGCAAGGCAAGA-3'。结果显示该引物有较强的特异性,6株样品野毒株均可扩增出长894 bp的片段,疫苗株不能扩增,且野毒株的H基因上存在9个较为规律的碱基（氨基酸）变异位点,而疫苗株在第277位氨基酸上均为天冬酰胺,这些变异可能导致N-糖基化位点的增加,从而对犬瘟热病毒疫苗株的毒力产生影响。本研究建立的AS-PCR方法能有效区分犬瘟热疫苗和Asia-Ⅰ型野毒株。     

The Establishment of AS-PCR Method to Distinguish Canine Distemper Asia-I Type Wild Strains and Vaccine Strains

Canine distemper (CD) is a contagious disease, which can damage the immune system, respiratory system, digestive system, and even nervous system, leading to systemic pathological changes, and has a huge threat to pet dogs, fur animals, etc. At present, the commonly used colloidal gold test cannot effectively distinguish vaccine immunity from animal natural infection. To establish an efficient and accurate detection method for identifying wild strains and vaccine strains of canine distemper virus(CDV), the whole genome of six canine distemper wild strains isolated from dogs and three widely used CDV vaccine strains collected from Wuhan area were sequenced. After comparing and analyzing the amino acid and the base sequences, the H gene was determined as the target gene for AS-PCR primer design. By genotyping the H gene, it was found that the prevalent CDVs in Wuhan were all Asia-Ⅰ, while the vaccine strain Y2 was America-I, and the vaccine strains Y1 and Y3 were both America-Ⅱ. Comparing the CDV-H gene sequences of 179 Asia-Ⅰtypes (6 wild-type strain samples + 173 GenBank Asia-Ⅰtype stains) and 3 vaccine strains, using AS-PCR technology (3'mismatch) to design a pair of primers. It can effectively distinguish CDV Asia-I wild strain and vaccine strain. The upstream primer sequence is 5'-TTAATATAATAATGACAGTG-3', and the downstream primer sequence is 5'-CCTCAAGGGGCACA-3'. The results showed that the primer had a strong specificity and the wild strains could amplify an 894 bp fragment, while the vaccine strains could not. There are 9 more regular bases (amino acids) variation sites in H gene of wild strain, and the 277th amino acids of all vaccine strains are Asparagine. These mutations may lead to an increase in N-glycosylation sites, which will have an impact on the virulence of canine distemper virus vaccine strains. The AS-PCR method established in this study can effectively distinguish the canine distemper vaccine and Asia-Ⅰwild strains.     

犬瘟热病毒自然感染犬淋巴组织中T、B细胞变化的研究

为了调查患犬瘟热病犬淋巴组织中T、B细胞变化的特点及淋巴细胞减少的发病机制,试验通过免疫组织化学的方法观察了T细胞(用CD3和CD45RO检测T细胞)、B细胞(用IgG、IgM抗血清检测B细胞)和犬瘟热病毒(抗犬瘟热病毒抗体)在病犬淋巴组织中的分布。结果表明:在淋巴组织中的淋巴细胞、淋巴小结中树突状细胞和巨噬细胞中均检出了抗病毒阳性反应细胞。在骨髓组织的前髓细胞中也发现抗病毒阳性反应细胞和嗜酸性胞浆内及核内包涵体的存在。与对照组相比,CD3和CD45RO阳性细胞主要存在于T细胞的分布域;但CD3和CD45RO阳性T细胞的数量较少。位于淋巴组织中的巨噬细胞有的被CD45RO染成阳性。在B细胞分布的区域中,IgG、IgM阳性细胞的数量明显减少;一些位于淋巴组织的浆细胞也被IgG或IgM染成阳性。在淋巴组织中淋巴细胞减少的顺序为:IgG阳性细胞减少最明显,其次为IgM和CD45RO阳性细胞,再次为CD3阳性细胞。依据试验结果,作者认为病犬淋巴组织中淋巴细胞减少主要是由B细胞缺乏所引起的;淋巴细胞的增殖能力减弱是引起淋巴组织中淋巴细胞减少的重要原因。     

北京地区犬瘟热病毒分离株H基因的分型

根据发表的犬瘟热病毒(CDV)参考毒株Onderstepoort的序列设计了一对引物,以感染犬瘟热病毒的犬的粪便总RNA为模板,RT-PCR扩增出17株CDV的H全基因1877bp的片段,将这个片段连接到pGEM-Teasy载体上,经酶切鉴定得到阳性克隆,将阳性质粒进行序列测定,并与国内外毒株进行同源性比较和系统发育分析,结果显示17株均为Asia-1型。北京地区流行的毒株主要是America-1型和Asia-1型,其中2007年主要流行America-1(疫苗型),而2008年主要是Asia-1型。