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相似文献
 共查询到18条相似文献,搜索用时 109 毫秒
1.
本研究参照已发表的PCV2基因组序列,设计合成1对特异性引物,以PCV2基因组DNA为模板,PCR扩增了长约480 bp的ORF2基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。采用亲和层析法在变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.396 mg/mL。纯化蛋白经免疫印迹、间接ELISA检测证明具有良好的抗原性和特异性。  相似文献   

2.
经生物学软件DNAStar分析,参照已发表的禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)(H5N1)基因组序列,设计合成1对特异性引物,RT-PCR扩增了长约750 bp的M1基因片段,将目的片段定向克隆至pET30a表达载体,经酶切及测序鉴定正确后转化BL21表达菌,经IPTG诱导获得以包涵体形式表达的重组蛋白。将重组蛋白变性、纯化和复性后,BCA法测定纯化蛋白的浓度为0.656 mg/mL,免疫印迹检测结果表明,纯化的重组蛋白具有良好的反应活性。将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,间接ELISA检测结果表明,重组蛋白可产生抗M1蛋白特异性抗体,具有良好的免疫原性。本研究成功表达了流感病毒H5N1的基质蛋白M1,且重组蛋白具有良好的免疫原性,为进一步研制H5N1亚型流感病毒诊断试剂及基因工程疫苗奠定基础。  相似文献   

3.
为了获取大量具有免疫原性的早孕因子(EPF)重组蛋白,通过PCR技术扩增得到Hela细胞EPF基因片段,与pREST-A连接。将质粒pREST-A-EPF转化大肠埃希菌BL21后IPTG进行诱导表达,采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化重组蛋白后,再用SDS-PAGE和Western blot分别鉴定其纯度和特异性。结果表明,EPF cDNA以正确的阅读框架插入表达载体pREST-A,经IPTG诱导后高效表达EPF重组蛋白,Western blot表明其与抗EPF抗体特异性结合。论文构建了EPF的原核表达载体,纯化获得了重组蛋白,为进一步开展EPF蛋白的相关研究和猪早孕诊断试剂盒的开发奠定了基础。  相似文献   

4.
本研究旨在克隆和表达水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)特异性抗原N蛋白,进而纯化并分析其免疫原性。根据GenBank中已发表的VSV基因组N基因序列,分别合成VSV两种不同血清型的N基因,经序列对比分析后,设计合成1对特异性引物,PCR扩增获得约1 300bp的N基因片段,将目的片段亚克隆至pColdⅠ原核表达载体中,经IPTG诱导表达后,采用Ni-NTA树脂亲和层析法纯化重组N蛋白。SDS-PAGE分析表明,N基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白大小约为50ku;Western blotting检测结果表明,该重组蛋白与VSV多克隆抗体发生特异性反应。本试验成功构建了VSV-IND和VSV-NJ的原核表达载体,实现了N蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达,纯化后的重组蛋白具有良好的免疫原性。  相似文献   

5.
经生物学软件DNAStar分析,以牛传染性鼻气管炎病毒(Banha Nu/67)基因组DNA为模板,PCR扩增gD基因943bp的片段,将目的片段定向克隆到pET30a表达载体中,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到部分可溶表达的重组蛋白。用Ni柱亲和层析法在非变性的条件下纯化重组蛋白,纯化的重组蛋白浓度为0.852mg/mL,纯度为85.2%。Westem blot、间接ELISA检测证明纯化的重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。  相似文献   

6.
参照IBRV基因组序列,设计合成1对特异性引物,扩增了长约846 bp的gD基因片段。将目的片段定向克隆到pET-30a原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21(DE3)表达菌,经IPTG诱导得到了以可溶性形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。本研究利用原核表达系统成功表达具有良好抗原性的gD蛋白,为IBRV的深入研究及诊断试剂的研制奠定了物质基础。  相似文献   

7.
为获得针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)GP5蛋白的特异性纳米抗体,并鉴定其抗原结合活性,以本实验室前期获得的PRRSV GP5蛋白特异性纳米抗体VHHGP5基因片段为模板,使用PCR对目的片段进行扩增,将扩增的片段经双酶切处理后连接到pColdSUMO-FLAG载体上,随后转化至E.coli TOP 10感受态细胞。经菌液PCR鉴定,将构建成功的重组质粒转化至E.coli BL21 (DE3)感受态细胞,用IPTG作为诱导剂对目的蛋白进行诱导表达,表达产物通过Ni-NTA亲和层析柱纯化。通过SDA-PAGE凝胶电泳分析表达及纯化后的蛋白,同时使用ELISA方法检测纯化后的纳米抗体效价,并使用Western blot鉴定纯化后的蛋白。SDS-PAGE结果显示,成功获得了大小约36 kDa的重组蛋白,利用原核表达系统制备的PRRSV GP5特异性纳米抗体重组蛋白以可溶性形式表达;ELISA结果显示,该纳米抗体结合抗原的效价为1:50 000;Western blot结果显示,该纳...  相似文献   

8.
为原核表达Tml6和Tm18重组蛋白,本研究以自然感染羊源脑多头坳原头节基因组DNA为模板分别扩增Tml6和Tm 18杭原基因全基因片段,测序鉴定后合成其开放阅读框架DNA片段,将基因组序列中的内含子去除并对其稀有密码子进行改造优化,构建重组表达质粒pGEX-Tm 16和pGEX-Tml8.转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物并进行纯化.结果显示:在大肠杆菌中表达出带有GST标签的大小约为39.6 ku和39.4 ku的重组蛋白,经谷胱甘肤琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性的GST-Tm 16及GST-Tml8重组蛋白,western blot分析表明重组蛋白均能够被兔抗GST单克隆杭体特异性识别.  相似文献   

9.
目的选取PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的片段进行重组表达。方法对PPRV和RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa蛋白片段基因进行大肠杆菌偏爱密码子优化后人工合成,利用分子生物学技术,将目的基因分别克隆至原核表达载体pET-28a(+)构建重组表达质粒,将重组表达质粒转化至E.coliBL21(DE3),诱导表达并纯化PPRV与RPVN蛋白中51-175aa、376-525aa片段。结果得到了分子量分别约17.8kD、20.6kD的各两段融合蛋白。结论本研究成功表达了PPRV和RPVN蛋白中抗原性较强、氨基酸差异性较大的51-175aa和376-525aa蛋白片段,为制备能区别PPR和RP病毒的特异性单抗提供了抗原。  相似文献   

10.
子孢子与裂殖体2(spm2)是环形泰勒虫重要的表面抗原。为了深入研究环形泰勒虫spm2主要抗原区域spm-N蛋白的功能,利用大肠杆菌表达系统表达重组spm-N蛋白并进行纯化及鉴定。通过序列设计合成特异性引物,利用PCR扩增环形泰勒虫spm-N基因片段,将目的片段定向克隆至表达载体pET30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,用IPTG诱导表达重组蛋白。结果显示:重组spm-N蛋白以可溶性的形式表达,获得了较高纯度的spm-N蛋白,且该蛋白的反应原性和特异性均较好。本研究成功表达了重组spm-N蛋白,为深入揭示spm-N蛋白的功能提供了依据。  相似文献   

11.
参考牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)基因组序列设计1对引物,扩增出650 bp的E0基因片段。将目的片段克隆至pMD18-T载体,经酶切鉴定获得阳性重组质粒并对其进行测序。将E0基因定向亚克隆到pET32a表达载体中,酶切及测序鉴定正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白经亲和层析法纯化后,免疫印迹检测证明纯化的重组蛋白具有良好的活性。  相似文献   

12.
田莉莉  李丽 《中国家禽》2012,34(6):29-32
为建立一种快速的新城疫病毒(NDV)抗体检测方法,参照已发表的NDV基因组序列,设计合成1对特异性引物,PCR扩增了长约1044bp的HN基因片段。将目的片段定向克隆到pGEX-6p-1原核表达载体,酶切及测序鉴定均正确后,转化BL21表达菌,经IPTG诱导得到了以包涵体形式表达的重组蛋白。重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测证明具有良好的抗原性和特异性。以该蛋白作为诊断抗原,建立了检测新城疫病毒抗体的间接ELISA诊断方法。该方法批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)相比较,符合率、敏感性和特异性分别为92.0%、91.0%和93.6%。  相似文献   

13.
根据GenBank公布的日本脑炎(Japanese encephalitis virus,JEV)SA14-14-2减毒株E基因的核苷酸序列,设计并合成一对特异性引物,采用RT-PCR方法扩增其E基因全长cDNA,将扩增产物克隆入pUCm-T载体中,测序后亚克隆到原核表达载体pET-32a( ),筛选重组质粒,转化大肠埃希菌BL21(DE3)宿主菌.经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表达产物.结果获得了含全长日本脑炎病毒E基因的重组质粒,经测序证实,与GenBank上E基因序列的同源性达到100%.所表达的融合蛋白主要以包涵体形式存在,为制备JEV实验室诊断抗原打下了基础.  相似文献   

14.
利用 PCR扩增乙型脑炎病毒 E蛋白基因 5′端片段 ,克隆入原核表达载体 p ET-2 8a,转化大肠杆菌 BL2 1 ( ED3 )。经 IPTG诱导表达后 ,SDS-PAGE分析表达产物。结果表明 ,所表达的E蛋白片段的分子量约为 3 .4万 ,表达量约占菌体总蛋白的 3 5%。 JEV E蛋白片段在大肠杆菌中的成功表达 ,为制备 JE实验室诊断抗原和分析 E蛋白基因结构与功能的关系提供条件  相似文献   

15.
为了表达基因4型戊型肝炎病毒(HEV)上海株ORF2编码蛋白并分析其抗原性,采用套式RT-PCR方法扩增上海猪基因4型HEV代表株结构蛋白基因ORF2部分片段,构建含有该基因片段的pET30a(+)重组表达质粒,命名为pET-E;将重组表达质粒转化大肠杆菌BL21,经1mmol/L IPTG诱导得到表达,进行SDS-PAGE分析,然后用Western blot鉴定其抗原性,最后纯化蛋白。结果:SDS-PAGE证明该片段得到融合表达,分子量为33 ku。Western blot分析表明,重组蛋白可以与HEV阳性血清反应,表明该蛋白具有良好的抗原性;该融合蛋白含有组氨酸标签,可以用MagExtractor-His-tag-kit进行纯化。用纯化的重组蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA检测89份猪血清样品,阳性率达80.4%,与已有的试剂盒检测结果相比,阳性符合率达95%。  相似文献   

16.
从E.coli C83902中扩增出不含信号肽序列的K88ac菌毛蛋白亚基基因片段,将其克隆到表达载体pQE-30中,构建了原核表达载体pQE30-K88ac,并转入E.coli XL1-Blue中,经IPTG诱导后,重组蛋白以包涵体形式获得高效表达.Western blot结果显示,表达的蛋白能够被K88ac单抗识别,用纯化的蛋白免疫小鼠,能够抵抗1 MLD大肠埃希菌强毒株C83902的攻击,这表明构建的工程菌株XL1-Blue(pQE30-K88ac)可以作为预防幼畜大肠埃希菌性腹泻基因工程菌苗的候选株.  相似文献   

17.
本文旨在构建抗菌肽parasinⅠ大肠杆菌重组表达载体,表达人工重组parasinⅠ,并检测其抑菌活性。根据parasinⅠ的成熟肽序列和大肠杆菌密码子偏好性,人工合成1段57 bp的基因编码cDNA,通过PCR技术构建大肠杆菌重组表达质粒pET32-ParaⅠ,并在parasinⅠ基因5’-端引入Xa因子酶切位点。重组载体转化大肠杆菌Rosetta(DE3)菌株后,在不同温度(37和20℃)条件下对阳性转化子进行异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。结果表明:IPTG成功诱导了1个21 ku的融合蛋白表达,重组蛋白占菌体总蛋白质的45%~50%。在低温条件下产生的融合蛋白主要以可溶性形式存在。可溶性重组蛋白经亲和层析纯化后,用Χa因子进行酶切,酶切产物经琼脂孔扩散法抑菌活性检测,结果显示其对金黄色葡萄球菌有一定抑制作用。本试验实现了parasinⅠ的重组表达,表达产物经Χa因子酶切后具抑菌活性。  相似文献   

18.
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