禽流感病毒检测技术研究

禽流感病毒的检测方法主要分为血清学检测和分子生物学检测两大类。血清学检测方法包括琼脂凝胶扩散试验(AGP)、血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验( ELISA)、神经氨酸酶抑制试验(NIT)和病毒中和试验(VN)。随着分子生物学的发展,近两年国内外学者更加注重对禽流感病毒的分子生物学检测方法的研究。分子生物学检测方法包括RT-PCR、多重RT-PCR、多种改进的RT-PCR和基因探针技术。     

禽流感病毒分子生物学检测方法

禽流感是由流感病毒引起的一种人和动物的高度传染性疾病。由于其危害严重，快速、准确的诊断技术对于禽流感的防控显得非常重要。除常规的临床诊断、病毒分离鉴定、血清学检测外，分子生物学检测方法由于具有更加快速、准确的特点愈来愈受到重视，文章就禽流感病毒分子生物学检测方法研究进展做一综述，以期为有效地控制禽流感的流行和暴发提供有力技术支撑。     

禽流感的实验室诊断技术

禽流感是危害世界养鸡业的主要疫病之一。对该病的实验室诊断技术进行了介绍。从传统的禽流感病毒分离技术、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验以及琼脂扩散（AGP）试验,到目前发展很快的酶联免疫吸附试验（ELISA）,都各具特点,互有利弊。     

禽流感的实验室诊断技术

禽流感是危害世界养鸡业的主要疫病之一。对该病的实验室诊断技术进行了介绍。从传统的禽流感病毒分离技术、血凝（HA）和血凝抑制（HI）试验以及琼脂扩散（AGP）试验,到目前发展很快的酶联免疫吸附试验（ELISA）,都各具特点,互有利弊。     

加拿大发生高致病性禽流感

加拿大2007年9月28日向OIE报告，9月23日开始，萨斯喀彻温省Regina地区发生高致病性禽流感。疫情于9月27日确定，病原是H7N3禽流感病毒。诊断方法为临床检查和实验室检测，实验室检测由加拿大食品检验局（CFIA）境外动物疾病中心（NCFAD）负责，方法包括神经氨酸酶抑制试验、PCR、测序、竞争ELISA、病毒分离和血凝抑制试验，结果均为阳性。疫区位于Regina海滨的家禽饲养场，感染动物是肉种鸡，涉及易感动物49100例，病例560例，死亡560例，未予扑杀。[第一段]     

禽流感检测方法研究进展

禽流感是一种可以感染多种禽类和人的烈性传染病，其病毒亚型众多，宿主范围广，病毒容易发生变异和重组，该病毒可以突破种间障碍感染人，具有重要的公共卫生学意义。近年来禽流感的发不仅给养禽业造成了毁灭性打击，而且该病的快速诊断与防治也提到了前所未有的高度。文章就近年来禽流感检测方法的发展概况进行了简单的综述，主要包括传统的病毒分离与鉴定、血清学诊断方法，以及为了满足快速检测的需要所发展起来的分子生物学检测方法。     

检测禽流感病毒抗体的重组核蛋白间接ELISA方法的建立

以大肠杆菌系统表达的H9N2亚型禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）为抗原，建立了禽流感间接酶联免疫吸附试验抗体检测技术（NP—ELISA）。对263份待检血清（包括临床收集的243份血清和20份H9N2亚型AIV免疫鸡阳性血清）进行检测，NP—ELISA与琼脂免疫扩散试验（AGP）的总符合率为83．3％，与血凝抑制试验（HI）的总符合率为92％。特异性试验表明，NP—ELISA方法可以检测H5、H7和H9亚型AIV特异性抗体，检测为阳性的血清样品能够被阳性鸡胚尿囊液阻断。敏感性试验证实，NP—ELISA最早可以检测鸡感染后7d的血清样品，并于感染后10d确定100％血清阳性，而AGP检测直到首免后21～28d才出现部分血清阳性，HI检测直到10～14d才出现部分血清阳性，并且NP-ELISA要比HI敏感4～40倍。试验证明，NP—ELISA是检测AIV血清型特异性抗体的一种特异、敏感、快速、经济的血清学检测技术。     

禽流感病毒检测方法研究进展

禽流感病毒由于亚型众多,且各亚型之间无交叉反应性,这使得禽流感病毒的检测工作较为困难.目前,传统的禽流感病毒检测方法主要是病毒分离和血清学方法.而分子生物学检测方法因其具有更加灵敏、特异、快速等特点,成为了当前禽流感病毒检测方法的主要发展方向.同时,人们也正致力于将一些新兴的检测方法应用到禽流感病毒的检测中来.论文就近年来禽流感分子生物检测方法和这些新兴检测方法的研究进展做一综述.     

禽流感检测方法研究进展

由A型禽流感病毒(AvianInfluenzaVirus熏AIV)引起的禽流感,又称禽流行性感冒,是由正粘病毒科,流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类烈性传染病。其临床症状和病理变化因感染禽的种类、年龄、病程长短、并发感染情况及感染毒株毒力等不同而表现不同,且无特征性性状和剖检变化眼1-4演。因此,禽流感诊断一直依赖于病原的分离鉴定。随着血清学实验技术和生物工程技术的飞速发展,禽流感诊断技术的研究也不断取得新进展眼5演。琼脂扩散试验、血凝和血凝抑制试验等常规方法的使用虽有一定的优势,但免疫荧光法和ELISA也日益显示出其快捷准确的特点:分子生物学的发展为核酸序列分析法的建立创造了条件,也使PCR熏RT-PCR及核酸探针等检测技术成为可能。本文就是对有关该病的诊断方法加以总结,并提出了认为比较可行的改进方法,旨在方便对禽流感做出及时而有效的诊断并采取相应措施。     

禽流感血凝抑制试验中的质量控制

自2003年12月17日韩国农林部向世界卫生组织(OIE)报告了该国发生高致病性禽流感疫情以后，在短短的两个月内，亚洲有10个国家和地区接连发生禽流感，我国也有禽流感病例。因此，平时做好对禽流感疫情的监测就显得至关重要。目前，我国已建立了禽流感琼脂扩散试验(AGP)、血凝抑制试验(HI)、神经氨酸酶抑制试验(NI)、间接酶联免疫吸附试验(ELISA)等血清学诊断技术，     

Development of a Duplex PCR Assay for Detection of Avian Influenza Virus and Chicken Parvovirus

In order to establish a method to simultaneously detect avian influenza virus (AIV) and chicken parvovirus (ChPV),two pairs of specific primers were designed according to the sequences of AIV M gene and ChPV NS gene in GenBank. The duplex PCR assay was established by optimizing the reaction conditions.The tests showed that this method had high specificity, could simultaneously detect AIV and ChPV and no specific band was amplified for other subtypes avian pathogenic virus. The sensitivity result showed that the lower detection limit of this method was 100 fg. The results of 159 clinical samples were consistent with the sequencing results of PCR positive product. The double PCR methods for detection of AIV and ChPV established in this study had the characteristics of good specificity and high sensitivity, which was of great significance to the prevention control of AIV and ChPV.     

H4、N2和所有亚型禽流感三重RT-PCR检测方法的建立

为建立一种同时检测H4、N2和所有亚型禽流感的方法,分别针对H4亚型禽流感病毒(AIV)HA基因、N2亚型AIV NA基因和所有亚型AIV M基因保守序列,设计筛选出3对特异性引物,优化引物之间的浓度,对三重反应体系进行特异性和敏感性验证,建立了H4、N2和所有亚型AIV三重RT-PCR检测方法,并用该法对临床样品进行检测。建立的方法能特异性扩增H4、N2和所有亚型AIV,与其他禽病病原体不发生交叉反应;对H4、N2和所有亚型AIV至少能检测到6 pg/μL。在185份临床样品的检测中,检出4份H4、10份N2和19份AIV阳性。所建立的三重RT-PCR方法特异性强、灵敏度高,为快速检测H4、N2和所有亚型AIV提供了有效的方法。     

Development and evaluation of a DAS-ELISA for rapid detection of avian influenza viruses

Rapid detection of avian influenza virus (AIV) infection is critical for control of avian influenza (AI) and for reducing the risk of pandemic human influenza. A double antibody sandwich enzyme-linked immunosorbent assay (DAS-ELISA) was developed for this purpose. The method employed a monoclonal antibody (MAb) as the capture antibody and rabbit polyclonal IgG labeled with horseradish peroxidase as the detector antibody, and both antibodies were against type-specific influenza A nucleoprotein (NP). The DAS-ELISA could detect minimally 2.5 ng of influenza viral protein in virus preparations treated with Triton X-100, which is equvilent to 2.5 x 10(2) EID50 virus particles. This DAS-ELISA could detect all 15n AIV subtypes (H1-H15) and did not cross react with other avian pathogens tested. The DAS-ELISA were directly compared with virus isolation (VI) in embryonated chicken eggs, the current standard of influenza virus detection, for 805 chicken samples. The DAS-ELISA results correlated with VI results for 98.6% of these samples, indicating a sensitivity of 97.4% and specificity of 100%. The method was further tested with H5N1 and H9N2 AIV experimentally infected chickens, ducks, and pigeons, as well as field samples obtained from central China in 2005. The DAS-ELISA method has demonstrated application potential as an AIV screening tool and as a supplement for virus isolation in Asia.     

Establishment of a Nested PCR Technique for Detection of H1 Subtype Avian Influenza Virus

In order to develop a simple and quick method to detect H1 subtype avian influenza virus (AIV),two pairs of primers were designed according to the sequences of HA gene of H1 subtype AIV, and a nested polymerase chain reaction (nPCR) method was developed for detection of H1 subtype AIV. The specificity and sensitivity test showed that this nPCR was only specific to the H1 subtype AIV and could detect 13.2 fg/μL of AIV RNA. The results demonstrated that the optimized nPCR assay was rapid, specific and sensitive for detection of H1 subtype AIV.     

禽流感病毒分子生物学检测技术研究进展

禽流感(avian influenza,AI)是A型流感病毒引起的一种禽类传染病,同时也是一种人和动物之间的高度传染性疾病。近年来,禽流感病毒的分子生物学检测技术发展迅速,文章就此进行了综述。     

Development of a Duplex RT-PCR Assay for Detection of H9 and H6 Subtype AIV

This experiment was aimed to develop a method for simultaneous detection of H9 and H6 subtype avian influenza virus (AIV).Two pairs of specific primers were designed according to the conserved regions sequences of H6 and H9 AIV HA gene,a duplex RT-PCR simultaneous detection of H9 and H6 subtype AIV was developed by optimizing the PCR system such as the concentration of different primers and annealing temperature.It showed that all samples could be amplified specific bands from H9 subtype AIV single infection samples or H6 subtype AIV single infection samples,and the samples mix infection these two subtypes AIV.No specific bands of the same sizes were amplified from genomic materials of other avian pathogens.The detection limit of the duplex RT-PCR was 5×10⁴ copies/μL. It suggested that this duplex RT-PCR assay was a specific,sensitive,stable and repeatable method for detection of H9 and H6 subtype of AIV,and could provide technical support for the monitoring of H9 and H6 subtype AIV.     

PCR制备地高辛标记的探针检测禽流感病毒核酸

用聚合酶链反应（PCR）技术,制备了广东禽流感无致病力分离株A/goose/China/24/96(H7N3）核蛋白基因片段（NPc）的地高辛标记的cDNA探针。建立并优化了检测禽流感病毒核酸的探针杂交法,探针杂交法能鉴别出非免疫鸡胚和SPF鸡胚尿囊液中的病毒,攻毒后第3天的SPF和非免疫鸡泄殖腔拭子中AIV的最大检出率为1/10,对临床样品中的AIV的最大检出率为1/7,而直接HA和HI法及AGP试验检不出临床样品的AIV。该探针具有较好的特异性和敏感性,为从分子水平探讨AIV的发病机理、临床早期快速诊断提供了新的研究手段。     

中国禽流感诊断技术和疫苗的研究进展

介绍了我国在禽流感诊断技术和疫苗研制方面的一些新技术、新成果，新特点和新思路，分析比较了目前建立的诊断方法和各类疫苗，从整体上展示了我国禽流感诊断技术和疫苗研究状况，对了解和掌握禽流感研究动态，优化禽流感监测手段，调整禽流感防疫策略等有一定的参考价值。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。