首页 | 本学科首页   官方微博 | 高级检索  
相似文献
 共查询到20条相似文献,搜索用时 125 毫秒
1.
ABC—Dot—ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒   总被引:4,自引:0,他引:4  
建立了ABC-Dot-ELISA检测鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的方法,其最佳反应条件是:包被液为0.05mol/LpH9.6的碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液(CBS),免疫IBV IgG的最佳工作浓度为1:80;抗原的最佳浓度为1:800;封闭剂选用0.01mol/L pH7.4含30mL/L白明胶的PBS,B-AgG和ABC-HEP的最佳工作浓度为1:200。用ABC-HEP的最佳工作浓度为1:20  相似文献   

2.
以猪瘟兔化毒接种猪肾细胞(PK-15细胞系),提取细胞培养物进行纯化,以纯化病毒抗原和酶标葡萄球菌A蛋白探索建立了检测猪瘟病毒抗体的PPA-ELISA方法,其最佳工作条件为:抗原包被浓度为2μg/mL,酶标A蛋白浓度1:30,底物作用时间30min。经对不同血清的检验,本法有较高的特异性和敏感性,同时本试验也证明ELISA与IHA检测结果具较高相关性。  相似文献   

3.
用蔗糖不连续梯度纯化的减蛋综合征*(EDS-76)病毒包被ELISA板,建立了检测EDS-76抗体的间接ELISA法。经测定,抗原最适包被浓度为1μg/mL,待检血清最佳稀释度为1:200,以OD490〉0.3,P/N〉2.1判为阳性结果。对4个鸡场的120份鸡血清进行检测,阳性率分别为0,43.33%,80.00%和93.33%。  相似文献   

4.
以在E.cloi高效表达的猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区为抗原,以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪IgG为二抗,建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法。经检测筛选出最佳反应条件为;1.2μg/孔纯化的E.coli表达的mE2重组蛋白包被酶标板,用10%的兔血清或马血清进行封闭,以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清。  相似文献   

5.
采用鸡传染性法氏囊病(IBD)病毒(IBDV-2512)研制了检测IBOV抗体的ELISA试剂盒。抗原最佳包被浓度为5.12μg/ml,被检血清最佳稀释度为1:200,酶标结合物最佳工作浓度1:1000.本试剂盒与美国KPIIBD-ELISA试剂盒比较,结果敏感性、特异性、重复性均达到美国同类产品水平,且易于操作.在4℃可稳定保存6个月、对北京地区4个非免疫鸡群的103只鸡测得其阳性率为54%,对45只SPF鸡的阳性率为0%。  相似文献   

6.
以在E.coli高效表达的猪瘟病毒E2基因主要抗原编码区(mE2)为抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的兔抗猪IgG为二抗,建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ELISA方法。经检测筛选出最佳反应条件为:12μg/孔纯化的E.coli表达的mE2重组蛋白包被酶标板,用10%的兔血清或马血清进行封闭,以正常E.coli裂解上清液稀释待检血清。试验表明应用重组mE2蛋白作为诊断HCV抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。  相似文献   

7.
IBDV VP2/VP243基因DNA疫苗表达质粒的构建与表达   总被引:2,自引:0,他引:2  
将传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2/VP243插入真核表达载体pcDNA中,置于CMV启动子的调控之下,构建成DNA疫苗表达质粒pcDNA VP2和pcDNA VP0。分别转染CEF细胞后,于24、48、72h取细胞裂解液进行ELISA、SDS-PAGE和Western blot检测,pcDNA VP2于转染后24h呈阳性反应,48h表达量高于24h;pcDNA VP0于转染后48h呈阳性反应  相似文献   

8.
ELISA检测兔巴氏杆菌病抗体的研究   总被引:3,自引:0,他引:3  
应用EDTA处理和超声波裂解法提取多杀性巴氏杆菌的荚膜多糖和外膜蛋白抗原,包被酶标板,用HRP-SPA代替酶标抗体,建立了检测兔多杀性巴氏杆菌病抗体的间接法ELISA。试验确定抗原的包被浓度为6.05μg/ml,HRP-SPA的适宜稀释度为110000,血清ELISA滴度在1400以上判为阳性。测定了多杀性巴氏杆菌灭活菌苗免疫兔血清10份,均呈阳性,抗体滴度在11280~140960范围内呈正态分布;血清几何平均效价为15120。重复4次测定10份阳性血清,其OD值之标准差(SD)<0.10,变异系数(CV)<10.0%。本法与琼脂扩散沉淀试验相比,敏感度提高约1575倍。ELISA不仅敏感、特异、快速、简便,而且经济、易于重复,适于推广应用。  相似文献   

9.
将表达有蓝舌病毒VP7蛋白的Sf21细胞超声波处理制备VP7抗原,建立了VP7-ELISA检测蓝舌病抗体的方法,确定阴性阳性判定界值及最佳反应条件:待检牛血清阳性下限为3.0,羊血清阳性下限为2.4,VP7抗原包被浓度为1:800,用含5%健康鸡血清的磷酸盐缓冲液作封闭液,待检血清1:100稀释,豚鼠抗牛羊IgG-HRP结合物1:500稀释,37℃避免显色4min~6min。试验结果表明:VP7可与23个不同血清型BTV抗体反应,具有较高的群特异性和敏感性。  相似文献   

10.
Dot—ELISA检测猪生殖和呼吸综合征抗体的研究   总被引:10,自引:3,他引:7  
用差速离心法提纯PRRS病毒,利用NC膜作为载体,在国内外首次成功建立了检测PRRS血清抗体的斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)。抗原包被浓度为100μg/ml,被检血清工作浓度为1:10,酶标兔抗猪IgG工作浓度为1:600。对72份北京地区猪血清分别用Dot-ELISA和IF检测,Dot-ELISA检测阳性率为33.3%,IF检测阳履率为30.6%,与IF符合率较高,对部分待检血清检测  相似文献   

11.
【目的】 建立基于绵羊肺炎支原体表面脂蛋白P60的间接ELISA方法。【方法】 利用生物信息学软件对P60蛋白进行抗原性分析,筛选出抗原性最佳的区域,扩增目的基因后构建重组表达载体并进行基因测序,将测序正确的质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,用IPTG诱导抗原性最佳蛋白表达并进行诱导时间优化;利用SDS-PAGE分析该蛋白分子质量大小及其表达形式。以重组蛋白作为抗原,绵羊肺炎支原体阳性血清作为抗体,通过Western blotting方法分析其反应原性。以重组蛋白为包被抗原,建立抗原性最佳蛋白的间接ELISA抗体检测方法,用该方法对20份阴性血清进行检测,计算阴阳临界值;检测该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份绵羊临床血清样本进行检测。【结果】 经DNAStar分析,P60蛋白第58-928位氨基酸区域的平均抗原指数在0.8~1.7之间,亲水指数为0~2.0,证明该区域(P6058aa-928aa)抗原性和亲水性较强;通过PCR扩增得到P6058aa-928aa基因,并构建重组表达载体,通过基因测序证明该重组表达载体与预期结果一致。SDS-PAGE结果显示,IPTG诱导浓度为1 mmol/L,诱导10 h时蛋白表达量较高,蛋白分子质量为42 ku,在大肠杆菌中以包涵体的形式表达;Western blotting结果表明,构建的重组蛋白具有良好的反应原性。对ELISA各条件进行优化结果显示:抗原包被浓度为0.5 μg/mL,一抗最佳稀释浓度为1∶100,最佳孵育时间为1.5 h,酶标二抗最佳稀释倍数为1∶4 000,判定阴阳性血清的临界值为0.36。对口蹄疫病毒(FMDV)、小反刍兽疫病毒(PPRV)、布氏杆菌(Brucella)、牛支原体(Mb)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)的标准阳性血清的检测均为阴性,证明该方法特异性较强;敏感性试验结果表明,血清稀释度为1∶2 048时仍为阳性;批内重复试验和批间重复试验的变异系数均<10%,证明该方法具有较好的重复性。利用所建立的间接ELISA方法与间接血凝法对92份羊血清检测结果表明,二者的阳性符合率为81.6%,阴性符合率为92.6%,总符合率为88.0%。【结论】 本研究建立的间接ELISA方法可用于临床样本的检测,为绵羊肺炎支原体的疫苗免疫效果评价和疾病诊断提供了较为可靠的方法。  相似文献   

12.
本研究旨在通过在Bac to Bac系统中表达非洲猪瘟病毒(ASFV)的P72基因,为进一步研究P72基因的结构、功能和免疫学特性奠定基础。本研究从含P72全长基因的菌株pGEX-6p-1-P72中扩增出P72基因全序列1941 bp,将扩增的基因连接于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建重组质粒pFastBac HTa-P72,转化至感受态DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-P72,再将其转染至Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。经Western blotting和夹心ELISA分析,结果表明,P72在昆虫细胞Sf9中获得正确表达,重组P72蛋白可被特异性兔抗ASFV P72血清、P72单抗识别。结果提示,Bac to Bac系统表达的P72重组蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性,为快速诊断ASF提供良好的候选抗原。  相似文献   

13.
采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。  相似文献   

14.
比较非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)全长p72与截短p72蛋白(p72s)的抗原性,为ASFV特异性抗体检测技术研究提供试验依据。应用大肠杆菌表达系统表达p72和p72s蛋白,应用Western blot和液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)技术鉴定表达的蛋白,分析蛋白的抗原表位;用纯化的重组全长和截短p72蛋白分别免疫小鼠,比较其免疫原性;通过ELISA和Western blot,评价重组p72和p72s蛋白与ASFV阳性血清的免疫反应性。结果:重组p72和p72s蛋白均以包涵体形式表达,相对分子质量分别约为76和42 ku,与预期大小相符;表达蛋白的酶解肽段对p72和p72s蛋白推测氨基酸序列的覆盖度分别为89.3%和88.39%,两者分别包含27和17个抗原表位;用p72与p72s蛋白免疫小鼠3次后,血清特异性抗体效价分别为1∶200~1∶25 600和1∶12 800~1∶409 600;基于重组p72与p72s蛋白的ELISA从108份猪血清中分别检出78份(72.2%)和85份(78.7%)阳性血清,两者的检测结果具有很好的一致性(kappa=0.826,P=0.016);经Western blot检测的10份ASFV抗体阳性血清中有7份与p72蛋白反应,全部与p72s蛋白反应。截短p72蛋白比全长p72蛋白的抗原性好,更适合用于ASFV抗体检测。  相似文献   

15.
【目的】建立非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)ELISA抗体检测方法。【方法】以重组截短p72(p72s)蛋白作为检测抗原,通过方阵滴定法,确立ELISA的抗原、待检血清和酶标抗体的最佳工作浓度,优化抗原包被、酶标板封闭、血清/酶标抗体反应及底物显色等工作条件;应用受试者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线阈值评价标准,确定方法的阴阳性临界值;检测方法的特异性、敏感性、批内与批间重复性;最后分别用建立的ELISA方法和商品试剂盒检测124份血清,比较两者的阳性检出率,并通过Western blotting验证ELISA的检测结果。【结果】ELISA方法的抗原最佳包被浓度为0.5 μg/mL,待检血清与酶标抗体的最适稀释度分别为1∶100和1∶5 000;反应条件为:抗原于37 ℃孵育1 h后经4 ℃包被酶标板过夜、于37 ℃封闭1 h或室温封闭2 h、待检血清和酶标抗体分别于37 ℃反应60和45 min及加入底物后于室温避光显色20 min;阴阳性血清的判定标准为:当待检血清的D450 nm值≥0.365时,判定为阳性;当D450 nm值<0.365时,判定为阴性。该方法只与ASFV阳性血清发生特异性结合,与猪瘟病毒、伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒抗血清均无交叉反应;能检测到ASFV抗血清中的总蛋白量为0.091~0.153 mg/mL,低于商品试剂盒的最低检测量(0.110~0.554 mg/mL);批内和批间重复性试验的平均变异系数分别为4.70%与5.125%。对临床血清样本检测时,建立方法和商品试剂盒的阳性检出率分别为75.81%(94/124)和32.26%(40/124)。进一步验证表明,Western blotting与ELISA的检测结果完全一致。【结论】建立了基于ASFV-p72s蛋白的ELISA抗体检测方法,该方法特异、敏感和重复性稳定,能够用于ASF临床诊断与流行病学调查,具有极大的开发应用潜力。  相似文献   

16.
为研究真核表达非洲猪瘟病毒(ASFV)主要结构蛋白p72,本研究从含ASFV p72基因全序列的重组质粒pGEX-6p-p72中扩增出1 941 bp的p72全长基因,将其插入于pFastBac HTa杆状病毒载体中,构建了重组质粒pFastBac HTa-p72,转化至感受态细胞DH10Bac中,获得重组杆粒rBacmid-p72。再将其转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。Western blot和夹心法ELISA分析表明ASFV p72基因在昆虫细胞sf9中获得了正确表达,重组p72蛋白可以被特异性抗ASFV血清、p72单克隆抗体识别,表明该蛋白特异性强、活性稳定,具有良好的抗原性。为进一步研究p72蛋白的结构、功能和免疫学特性奠定基础。  相似文献   

17.
本研究利用纯化的原核表达乙型脑炎囊膜E蛋白作为包被抗原,建立了乙型脑炎间接ELISA诊断方法。对检测的各种条件进行了优化,优化反应条件后确定的抗原最适包被浓度为2μg/mL,抗原最佳包被条件为37℃包被2 h,血清的最适稀释度为1∶160,酶标抗体最适稀释度为1∶5000,最佳封闭条件为1%BSA,阴阳性临界值判定标准为D492 nm=0.254。该方法不与猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒阳性血清反应,其D492 nm0.254,说明该方法具有良好的特异性。采用该方法对150份疑似乙型脑炎血清样品进行检测,结果显示,与某猪乙型脑炎试剂盒相比符合率为90.77%,表明建立的间接ELISA方法具有较高的敏感性和特异性,因此,本研究成功建立了能特异性检测抗乙型脑炎血清抗体的ELISA检测方法。  相似文献   

18.
In order to obtain purified peste des petits ruminants virus F protein, the F gene of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07 was cloned into transfer vector pFastBac/CT-TOPO, plasmid pFastBacCT-PPRV-F was then transformed into DH10Bac complement cells. The recombinant bacmid DNA was isolated and transfected into sf9 insect cells to express F protein. The expressed F protein was identified by using SDS-PAGE, Western blotting and indirect immunofluorescence assay. The recombinant F protein was successfully expressed in insect cells with a relative molecular of 59 ku.The sf9 cells infected by Bacmid-PPRV-F can reacted with positive serum of peste des petits ruminants.Using the Bac-to-Bac baculovirus expression system expressed the F protein of peste des petits ruminants virus strain Tibet 07.This work provides basis for development of rapid test for detection of peste des petits ruminants antibody.  相似文献   

19.
旨在建立牛副流感病毒3型(BPIV3)抗体间接ELISA检测方法。克隆NP-HN截短串联基因并构建原核表达载体pET28a(+)-NP-HN,诱导纯化NP-HN重组蛋白作为包被抗原,优化ELISA反应条件,建立BPIV3抗体间接ELISA检测方法,进一步与病毒中和试验和进口ELISA试剂盒进行比较,应用本方法对270份临床血清样本进行了检测。结果表明,表达的NP-HN重组蛋白大小为44ku,具有良好的反应原性,建立的ELISA检测方法特异性强,与牛的主要呼吸道病原如牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒等均无交叉反应,批内和批间重复性试验的变异系数小于8%,与病毒中和试验和进口商品化ELISA试剂盒的总符合率分别为96.67%和98.89%。对采自山东、辽宁和天津的270份临床血清样本检测后总的阳性率为82.59%(223/270)。建立的BPIV3抗体间接ELISA方法具有较好的特异性和敏感性,可应用于BPIV3的流行病学调查和抗体检测研究。  相似文献   

20.
【目的】试验旨在表达与纯化非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)的结构蛋白p22,将其作为包被抗原建立ASFV抗体的间接ELISA检测方法,用于诊断非洲猪瘟。【方法】将ASFV p22编码基因KP177R的截短体(24―145位氨基酸)克隆至原核表达载体pET-32a (+)中,将重组质粒pET-32a-p22转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经0.1 mmol/L IPTG诱导表达5 h,利用镍柱亲和纯化p22蛋白,并进行Western blotting鉴定。利用p22蛋白免疫BALB/c小鼠制备抗血清,并以含p22全长基因的真核表达质粒pCAGGS-EGFP-fp22转染HEK293T细胞为抗原基质,利用间接免疫荧光(IFA)鉴定抗血清的反应性。以重组p22蛋白为包被抗原,优化最佳抗原包被浓度、待检血清稀释度、封闭条件、抗原抗体反应时间、酶标二抗工作浓度等参数,建立ASFV抗体间接ELISA检测方法,并对临床猪血清样品进行检测。【结果】ASFV p22截短蛋白在大肠杆菌中高水平表达,蛋白产量为0.85 mg/100 g菌体;p22蛋白具有良好的免疫原性,小鼠血清抗体效价为1:12 800。本研究建立的ELISA方法(p22-ELISA)的最佳抗原包被浓度为0.125 μg/孔,最佳待检血清稀释度为1:800,最佳酶标二抗稀释度为1:10 000;阴阳性临界值为0.384;与CSFV、PRRSV、PCV2、PRV等抗体阳性猪血清无交叉反应,说明特异性好;批内与批间变异系数均低于10%,表明重复性好。利用p22-ELISA方法检测了263份临床猪血清样品,与商品化ASFV抗体ELISA检测试剂盒的符合率为97.7%。【结论】本研究基于原核表达的p22截短体蛋白建立了用于检测ASFV抗体的间接ELISA方法,该方法特异性强、灵敏度高、重复性好,为ASFV感染诊断和流行病学调查提供了技术支撑。  相似文献   

设为首页 | 免责声明 | 关于勤云 | 加入收藏

Copyright©北京勤云科技发展有限公司  京ICP备09084417号