禽源空肠弯曲杆菌的分离鉴定及其致病性的初步研究

本研究对广东部分地区不同品种家禽空肠弯曲杆菌的流行状况进行了调查。通过菌落和菌体形态、生化特征、培养特性等生物学特性和多重PCR方法对所分离菌株进行鉴定,结果表明广东地区鸡、鸭和鹅空肠弯曲杆菌的带菌率分别为7.93%、2.46%和4.16%。从分离株中选取10株进行了致病性试验,结果表明禽源空肠弯曲杆菌对雏鸡的主要病理变化是腹泻便血,肝脏出现白色坏死灶,盲肠充血、膨大充满气泡和红色内容物。     

鸡肉空肠弯曲杆菌的污染率与耐药性分析

空肠弯曲杆菌是一种常见的食源性病原菌.为了解四川省雅安市鸡肉中空肠弯曲杆菌的污染率及耐药性,采用组合生化法从雅安市场上采集的183份鸡肉样品中培养分离了36株疑似菌株,通过二重PCR的方法鉴定出空肠弯曲杆菌25株,其污染率为13.66％.采用肉汤微量稀释法,对空肠弯曲杆菌的药敏性进行了分析,所分离的菌株对环丙沙星、左氟沙星、克林霉素、四环素耐药率较高,分别为100％、100％、96％、84％,对链霉素、红霉素耐药率较低,分别为12％、4％,对氟苯尼考、庆大霉素敏感.     

弯曲杆菌中具有高抑菌活性乳酸菌的筛选

使用微生态制剂来替代抗生素用于动物疫病防制是未来的发展趋势,而乳酸菌是目前微生态制剂最主要的成分。试验旨在筛选弯曲杆菌中具有高抑菌活性并耐受动物胃肠道环境的乳酸菌。从广东不同地区采集家禽粪便样品,对分离的乳酸菌进行生化鉴定、PCR鉴定及16S rDNA测序。同时,对分离菌株进行鸡源空肠弯曲杆菌、鸭源空肠弯曲杆菌和鹅源结肠弯曲杆菌的抑菌试验,以及模拟胃肠道环境的耐酸、耐胆盐和耐胰蛋白酶试验。结果表明,唾液乳杆菌R3对不同禽源的弯曲杆菌都具有高抑菌活性和耐受能力。因此,唾液乳杆菌R3为开发防控家禽弯曲杆菌疾病的微生态制剂提供了候选株。     

应用SYBR Green I的Real-time PCR方法定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态(Viablebutnonculturable,VNC),所以传统的生化鉴定结果不一定可靠,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。本文基于LightCycler为平台,利用SYBRGreenI染料能特异与双链DNA结合而发荧光的特性,建立一种Real-timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时,发现所有空肠弯曲杆菌(11株)都呈阳性,所有其它弯曲菌(3株)和其它菌株(5株)都是阴性。整个检测过程60min内可以完成,检测限度为5CFU,标准曲线的相关系数为1。结果表明基于SYBRGreenI的定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。     

FHIT基因和Fhit蛋白在犬淋巴瘤细胞系中的畸变

空肠弯曲菌是人类主要食源性病原菌之一，其主要的储存宿主是家禽。据研究空肠弯曲杆菌主要定植于肉仔鸡的盲肠。从7个鸡群采集20份样本来检测弯曲杆菌，结果表明，平均发病率为65％。本试验还研究了48株空肠弯曲菌对INT～407细胞的黏附力和入侵力。用检测庆大霉素抗性的INT-407细胞对从盲肠内容物分离的48株空肠弯曲菌进行分析，盲肠分离菌株呈现出广泛的黏附力和入侵力，且菌株间的黏附力和入侵力呈显著相关（P〈0．01）。用PCR方法检测到空肠弯曲杆菌的毒力相关基因dnaJ、cadF、pldA、ciaB，检出率分别为100％、76％、31％、41％，     

基于TaqMan探针的Real-time PCR定量检测空肠弯曲杆菌

空肠弯曲杆菌 (Campylobacterjejuni ,C .jijuni)被认为是人类主要食源性病原菌之一。由于空肠弯曲杆菌特殊的生长条件和容易进入不可培养但存活的状态 (Viablebutnonculturable ,VNC) ,所以传统的生化鉴定结果并不一定可靠 ,并且是一项费时而繁琐的工作。核酸检测方法的出现为空肠弯曲杆菌的检测带来了方便。在本文基于LightCycler为平台 ,建立一种基于TaqMan探针的Real_timePCR方法来定量检测空肠弯曲杆菌。用该方法检测时 ,发现所有空肠弯曲杆菌 (11株 )都呈阳性 ,所有其它弯曲菌 (3株 )和其它菌株 (5株 )都是阴性。整个检测过程 6 0min内可以完成 ,检测限度为5CFU ,标准曲线的相关系数为 0 .988。结果表明荧光定量PCR方法既为空肠弯曲杆菌提供了一种特异、敏感、快速和简洁的定量检测方法 ,又为研究空肠弯曲杆菌致病机理提供了一种重要方法。     

15株禽源空肠弯曲菌的分离鉴定及CheW基因序列分析

为了解四川地区禽源空肠弯曲菌流行菌株的感染情况及其Che W基因的变异特点,本研究于四川地区采集禽源盲肠及内容物对空肠弯曲菌进行分离并纯化培养,将分离菌株进行染色镜检、生化试验、16S r RNA基因PCR鉴定,并对分离株的Che W基因进行克隆测序,选取Gen Bank中登录的10株国内外空肠弯曲菌菌株与分离株进行Che W基因的序列分析及遗传进化分析。结果显示:分离株经纯化培养于哥伦比亚血琼脂培养基上后出现无溶血现象的菌落;革兰染色为阴性;生化代谢类型较稳定且与相关报道一致;16S r RNA基因序列与空肠弯曲菌(NCTC11168、YQ2210)等菌株同源性为99%以上。15株分离菌株的Che W基因的核苷酸序列与所选参考株一致性为98.68%,其推导的氨基酸序列同源性一致性在98.9%以上。其中鹌鹑源分离株CJ-1、CJ-2、CJ-4、CJ-13、CJ-14在第22位和161位均出现单个碱基的置换为A→G。本实验中分离菌株均为空肠弯曲菌且分离菌株之间Che W基因保守性强,遗传变异动态性较弱。本研究为空肠弯曲菌遗传变异方面的相关动态研究提供参考依据。     

貂奇异变形杆菌的分离及其生物学鉴定

为分离貂奇异变形杆菌(P.mirabilis)并鉴定其生物学特性,本研究从临床病死貂的肝脏样品中分离出一株细菌,通过生物学特性检验及16S rRNA基因比对对该分离株进行鉴定.其中,应用PCR方法扩增出1504 bp的16S rRNA基因片段.经BLAST比对分析表明,与其同源性最高的均为P.mirabilis各株系的16S rRNA序列,同源性均高达98％以上.通过系统进化树分析表明,该分离菌株与10株参考菌的同源性为98.9 ％～99.9％,其中与HQ259932同源性最高(99.9％),检验结果表明,该分离菌为貂P.mirabilis.以0.2 mL/只(3.2×109 cfu/mL)菌液的剂量接种小白鼠,其发病率为100％,死亡率为60％,表明分离菌具有较强致病性.免疫保护性实验表明分离菌具有良好的免疫原性.此外,该分离菌株对头孢哌酮钠、卡那霉素、链霉素和阿米卡星敏感,对氧氟沙星、红霉素、恩诺沙星和阿莫西林等药物具有一定的耐药性.     

禽源空肠弯曲杆菌ERIC-PCR分型及毒力因子研究

[目的] 通过对禽源空肠弯曲杆菌分子分型和毒力研究,了解禽源空肠弯曲杆菌在禽肉产品生产过程中的主要传播途径和携带的主要致病因子。[方法] 对从家禽养殖场、屠宰场等采集的720份泄殖腔拭子和禽肉表面拭子样品分离的311株空肠弯曲杆菌进行ERIC-PCR分型和16种毒力因子检测。[结果] 禽源空肠弯曲杆菌的分离率为43.19%;肉鸡生产链中空肠弯曲杆菌沿生产链传播,且有优势菌株型;90%以上分离菌株携带11种毒力基因。[结论] 肉鸡生产链中空肠弯曲杆菌存在水平传播现象,且没有外源性污染;16种毒力基因中,14种毒力基因的携带率均在50%以上。加强禽源空肠弯曲菌的监测是控制空肠弯曲菌的前提,对公共卫生具有重要意义。     

猪源空肠弯曲杆菌的分离及鉴定

为了研究更快、更加准确分离空肠弯曲杆菌的方法,试验同时采用常规生化法对由12份猪盲肠内容物中分离的可疑菌进行检测,得到了6个阳性样品,经特异性PCR检测,2个样品可定性为空肠弯曲杆菌,检测时间为7 d;而对所得菌株直接进行PCR检测,检测结果相同,检测时间为2 d。结果表明:PCR可以快速、特异性地检测空肠弯曲杆菌,与常规生化检测法相比是一种更有效的方法。     

牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用

根据布鲁菌属特异性基因BCSP31和布鲁菌种间特异性标志IS711插入序列,设计合成了3对引物,以牛种布鲁菌544A、104M和羊种布鲁菌16M基因组DNA为模板,通过优化反应条件,建立了可同时检测布鲁菌属、牛种布鲁菌和羊种布鲁菌的多重PCR方法。牛种布鲁菌可扩增出301和114 bp 2条带,羊种布鲁菌可扩增出301和253 bp 2条带,该方法对牛种布鲁菌544A和羊种布鲁菌16M混合DNA模板的最小检出量为100 pg,对大肠杆菌O157∶H7、小肠结肠炎耶尔森菌等15种参照菌的核酸扩增结果均为阴性。应用该方法对吉林省某牛场的106份粪便进行检测,虎红平板凝集试验作对照,结果PCR检测9份为阳性,且全为牛种布鲁菌阳性,对应的虎红平板凝集试验也为阳性。结果表明,建立的多重PCR方法具有良好的敏感性和特异性,为布鲁菌病的鉴别诊断提供了一种分子检测工具。     

鸭Ⅰ型肝炎病毒VP1基因片段的克隆与表达载体的构建

为研究鸭肝炎病毒VP1基因在大肠杆菌中的表达情况,根据鸭肝炎病毒核苷酸序列设计1对外引物和1对含有EcoRⅠ和SalⅠ酶切位点的内引物。以内外引物进行PCR扩增,将所得PCR产物回收,以相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET-32a后构建重组表达载体,并转入宿主菌BL21和Rosseta,经酶切、PCR和测序鉴定,证明VP1基因正确插入了表达载体。用不同浓度的IPTG诱导VP1基因的表达,收集菌液进行SDS-PAGE电泳,结果表明,VP1基因片段在大肠杆菌Rosseta和BL21中均难以表达。     

禽大肠杆菌的分离与16S rRNA的鉴定

从疑似患有大肠杆菌病的病死鸡群中采取粪便样品,分离病原进行生化鉴定,从8份样品中分离鉴定出6株大肠杆菌。根据细菌16S rRNA 基因的高度保守性,设计合成大肠杆菌的共同引物,对随机选取的1株细菌进行PCR扩增,并与GenBank中的E.coli 16S rRNA进行序列比对,确定这株细菌与大肠杆菌的同源性达99%以上。本方法特异性好,为实验室鉴定大肠杆菌提供了一种简单、容易操作的手段。     

5株堆形艾美耳球虫线粒体cox3基因的扩增及序列分析

以5株堆形艾美耳球虫为研究对象,对其线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅲ亚基(cox3)的部分基因(pcox3)进行了PCR扩增、测序及序列分析,并与GenBank上已发表的顶复门原虫相关序列进行比较,研究其线粒体cox3基因遗传变异情况。结果每个虫株均获得572bp的目的片段,利用DNAStar软件进行序列比对,5株堆形艾美耳球虫线粒体pcox3序列完全一致,与疟原虫和住白细胞虫相应序列的相似性分别为51%和50%,而与泰勒虫的相似性少于50%。本研究首次报道了堆形艾美耳球虫pcox3序列,结果显示不同来源的堆形艾美耳球虫pcox3序列没有差异,与毒力无关,为进一步研究艾美耳球虫的群体遗传学奠定了基础。     

小鼠隐藏管状线虫线粒体cox1基因的扩增及序列分析

对从试验小鼠体内分离的蛲虫样品PMZ1-5的线粒体细胞色素c氧化酶第I亚基（cox1）的部分基因（pcox1）进行PCR扩增、测序及序列分析,并与网上相关序列进行比对分析,研究其线粒体pcox1基因遗传变异情况。结果表明,获得pcox1有效序列373 bp,经序列比对分析,发现5个蛲虫样品之间的变异很小,只有1个碱基的差异,序列相似性为99.73%～100%,BLAST分析结果表明为隐藏管状线虫,与同属的Syphacia montana序列差异性为5.24%～5.68%。结果表明,隐藏管状线虫的pcox1序列种内变异很小,种间差异明显,本结果为进一步研究蛲虫的群体遗传学奠定了基础。     

3种瘤胃纤维分解菌实时定量PCR方法的建立

为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响,本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16S rRNA分别设计引物,以山羊瘤胃液提取细菌总DNA,分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段,并连接至pMD-18 T Vector上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示,扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%;以不同稀释度重组pMD-18 T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,绘制标准曲线的相关系数均接近1,熔解曲线均呈单一峰值。因此,本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法,为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。瘤胃纤维分解菌;Real-time PCR;标准曲线;     

猪圆环病毒2型ORF3基因的原核表达

用原核表达系统表达猪圆环病毒2型ORF3基因,分析ORF3蛋白的抗原性。根据GenBank上公布的猪圆环病毒2型(PCV-2)核苷酸序列进行分析,针对ORF3基因设计并合成1对特异性引物,PCR扩增该基因,并将此片段克隆入原核表达载体pET-32a(+)上,命名为pET32a-ORF3,转化大肠杆菌Rosetta-blue(DE3) pLacⅠ感受态细胞,1.0 mmol/L IPTG 37 ℃诱导表达。结果表明,PCR扩增得到315 bp的片段,重组蛋白大小约为29 ku,与预期大小相符。Western blotting分析结果表明,重组蛋白能与抗His-tag的单克隆抗体反应,不与PCV-2阳性血清发生反应。猪圆环病毒2型ORF3基因能在大肠杆菌中成功表达,但与阳性血清之间没有反应原性,为进一步研究PCV-2 ORF3蛋白的功能及特性奠定基础。     

牛分枝杆菌融合基因ESAT6-MPB63-HSP65的原核表达及鉴定

以牛分枝杆菌Vallee Ⅲ株基因组DNA为模板,PCR扩增ESAT6、MPB63和HSP65基因,将其依次定向克隆入原核表达载体pET-32a (+),构建重组质粒pET-E6-M63-H65,将重组质粒转化到大肠杆菌BL21 (DE3) 感受态细胞,1 mmol/L IPTG诱导融合蛋白表达,以Ni2+亲和层析柱纯化表达的融合蛋白并进行Western blotting 分析。结果表明,rESAT6-MPB63-HSP65融合蛋白为可溶性表达,且大小与理论值相符,纯化的融合蛋白能够与抗牛分枝杆菌阳性血清发生反应,为进一步的诊断学研究奠定了基础。     

口蹄疫病毒灭活疫苗中VP1基因RNA抽提方法的建立

本试验提取疫苗种毒、BEI灭活病毒和白油乳化灭活疫苗病毒中的RNA,并就VP1基因进行了RT-PCR扩增、核酸序列测定和序列比对分析。结果显示,3种来源的VP1基因片段长度均为813 bp,与预期的目标相符,核苷酸序列显示3种方法处理的病毒VP1同源性为100%。说明灭活剂BEI和乳化工艺没有全部破坏口蹄疫病毒VP1基因核酸,为检测疫苗毒株的核酸序列建立了一种方法。