牛外周血单核巨噬细胞的分离、培养与鉴定

试验旨在为深入研究单核巨噬细胞的生物学特性和免疫学功能提供材料。应用牛淋巴细胞分离液从牛外周血中分离牛外周血单个核细胞,用含10%胎牛血清的RPMI1640营养液培养5d,在倒置显微镜下观察细胞形态,采用流式细胞术检测单核巨噬细胞表面特征性标志CD14。结果表明,获得的贴壁细胞具备巨噬细胞的形态学特征及免疫表型。通过形态学观察和流式细胞术鉴定可知,该试验成功获得了牛外周血单核巨噬细胞。     

IBRV对牛单核巨噬细胞吞噬鸡红细胞功能的影响

为研究牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）感染对牛单核巨噬细胞吞噬功能的影响,应用淋巴细胞分离液获得牛外周血单个核细胞,通过贴壁培养成为单核巨噬细胞。 IBRV 感染单核巨噬细胞24 h后加入鸡红细胞,测定被感染细胞对鸡红细胞的吞噬率。结果显示,单核巨噬细胞被IBRV 感染后,对鸡红细胞的吞噬率显著降低（P<0.05）。     

IBRV感染对牛单核巨噬细胞产生一氧化氮(NO)的影响

为探讨牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)感染牛单核巨噬细胞后的免疫机理,采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离牛外周血单个核细胞,再经贴壁培养获得单核巨噬细胞。应用Griess法检测接种IBRV后6、12、24、48h时间段的牛单核巨噬细胞分泌一氧化氮(NO)的含量,结果显示,单核巨噬细胞感染IBRV后产生NO的量均高于对照组(P<0.05),攻毒24h时巨噬细胞产生NO的量达到最高水平(607.87μmol/L)。结果表明,IBRV感染可以对单核巨噬细胞分泌NO的量产生影响,这可能和IBRV引起的致病机理有一定关系。     

水牛外周血单核巨噬细胞的培养与鉴定

本试验旨在为阐明水牛感染大片吸虫的免疫机理提供单核巨噬细胞材料。经过密度梯度离心分离,贴壁法培养水牛外周血单核巨噬细胞,以MTT法检测培养4、24、48、72、96、120、144、168、192 h时贴壁单核巨噬细胞的相对存活数量,结果显示贴壁细胞体外培养72、96、120 h时,细胞数量相对稳定,组间差异不显著(P＜0.05)。贴壁72 h的细胞通过倒置显微镜、瑞氏染色观察,结果显示其具备单核巨噬细胞的典型形态特征;酸性磷酸酶、非特异性酯酶染色阳性率分别为(72.8±0.5)%和(84.6±0.4)%,显示其具备单核巨噬细胞酶化学特性;贴壁细胞表达单核巨噬细胞特异性表面抗原MHC Ⅱ;墨汁的吞噬率为(87.5±0.6)%,表明该细胞具有单核巨噬细胞的吞噬功能。结果表明贴壁法分离,5% BSA的DMEM培养水牛外周血单核巨噬细胞,培养72 h贴壁细胞具备单核巨噬细胞特征,在细胞数量相对稳定期(72、96、120 h)可以进行相应的试验研究。     

猪肺泡巨噬细胞的分离与原代培养

从仔猪肺泡中分离巨噬细胞，对分离的细胞进行计数，接种6孔培养板进行原代培养，利用倒置显微镜对原代揞养的巨噬细胞进行形态学观察。结果表明，本试验采用的方法可获得足够数量的细胞，可用于分离培养猪肺泡巨噬细胞，能为开展相关病毒的细胞培养特性研究提供良好的试验材料。     

马传贫白细胞弱毒疫苗接种马攻击强毒后脾脏超微结构的观察

选接种马传贫弱毒疫苗并经强毒攻击后有三种形态学类型马各二匹,对其脾脏进行了超微结构观察。其中Ⅱ、Ⅲ型马脾内以免疫活性细胞活化、增殖为主,且与单核-巨噬细胞构成“免疫岛”;而Ⅰ型马脾内免疫活性细胞和巨噬细胞以变性、坏死性病变为主.从而进一步证实是T、B 和单核-巨噬细胞三种细胞协同免疫的结果。     

重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞分裂抑制作用

观察重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞的作用。无菌采取牛外周血，分离培养淋巴细胞，取第一代细胞，分为试验组和对照组。试验组加入不同浓度的重组牛γ-干扰素，作用5d，观察细胞数量及细胞凋亡效应。结果为试验组淋巴细胞数目下降，细胞凋亡效应减弱。试验结果表明，重组牛γ-干扰素对牛外周血淋巴细胞具有抑制分裂及抗凋亡的作用。     

牛磺鹅去氧胆酸对糖皮质激素引起小鼠免疫抑制的影响

采用80 mg/kg剂量的地塞米松对小鼠进行腹腔注射制备免疫抑制小鼠模型;牛磺鹅去氧胆酸(Taurochenodeoxycholic acid,TCDCA)设计了0.05、0.10、0.20 g/kg低、中、高3个给药剂量对小鼠灌胃给药;检测免疫器官质量,碳粒廓清法检测单核-巨噬细胞吞噬功能,流式细胞术检测外周血CD4+和CD8+细胞亚群百分率及CD4+与CD8+的比值,ELISA检测血清中IgG的含量.结果显示:模型小鼠和正常小鼠相比较,脾指数、单核-巨噬细胞吞噬功能、CD4+和CD8+亚群百分率及血清IgG含量均极显著降低(P＜0.01),说明地基米松制备的小鼠模型免疫功能极显著低下.给药组与模型组相比较,TCDCA的3个剂量组对小鼠脾指数均无显著影响(P＞0.05);低剂量组和中剂量组极显著增强单核-巨噬细胞系统吞噬功能(P＜0.01);3个剂量组均显著提高外周血中CD4+细胞百分率(P＜0.05),中剂量组显著提高CD4-与CD8-的比值(P＜0.05);低剂量纽和中剂量组显著提高小鼠血清中IgG含量(P＜0.05).结果表明,TCDCA对糖皮质激素免疫抑制小鼠的非特异性免疫和特异性细胞免疫、体液免疫功能具有恢复作用,但对脾脏萎缩无恢复作用.     

冷冻保存新生牛睾丸组织中支持细胞的分离纯化

睾丸支持细胞(sertoli cells,SCs)是生精上皮中的多功能体细胞,其分离培养对体外探讨精子发生机理至关重要。因牛新鲜睾丸组织取材不便,本试验在前期基础上探讨了从冷冻保存的新生牛睾丸组织中分离纯化SCs的可行性。将冻存的1日龄牛睾丸组织复苏,进行形态学检查和SCs分离培养。石蜡切片苏木精-伊红(HE)染色显示,曲细精索及睾丸间质保存完好。二步酶消化结果显示,生精上皮解离良好。利用差异贴壁法将原代细胞纯化后扩大培养,绝大多数细胞呈不规则多边形,3d即可生长至汇合。RT-PCR分析显示,贴壁细胞表达SCs阳性分子标记胶质细胞源神经营养因子(GDNF)和雄性激素结合蛋白(ABP)而不表达精原细胞分子标记PLZF。流式细胞术检测显示,所获细胞中ABP和GDNF阳性细胞数分别为99.7%和99.8%。以上结果表明,从冻存的新生牛睾丸组织中可获高纯度的SCs。本试验结果为后续相关试验奠定了基础。     

猪集落刺激因子和白细胞介素-4的真核表达及其体外诱导猪树突状细胞的研究

试验旨在建立猪集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor,GM-CSF）和白细胞介素-4（interleukin-4,IL-4）的真核表达体系,应用表达的2种细胞因子体外诱导猪树突状细胞并检测其细胞功能。首先构建GM-CSF和IL-4真核表达载体,并在HEK293细胞上进行表达验证;其次应用表达的2种细胞因子诱导猪骨髓源和血液源单核细胞;最后分别采用荧光显微镜、流式细胞术检测猪树突状细胞的表面标志CD1a、SLA-Ⅱ和SWC3a,并进行树突状细胞形态学和免疫学功能鉴定。结果显示,本研究构建的2种真核表达载体在HEK293细胞中成功表达GM-CSF和IL-4。形态学观察发现,细胞因子诱导的单核细胞培养3 d后有聚集现象,6 d时可观察到典型的树突状突起。流式细胞术检测发现,表达的细胞因子可成功诱导猪骨髓源和血液源单核细胞转化为树突状细胞,其SWC3a⁺/SLA-Ⅱ⁺和CD1a⁺/SLA-Ⅱ⁺双阳性比例显著提高,与商品化细胞因子处理组没有区别。细胞吞噬试验发现,表达的细胞因子诱导的树突状细胞为未成熟树突状细胞,具有很强的细胞吞噬能力。本试验成功建立了在真核细胞中表达猪重组蛋白GM-CSF和IL-4的方法,并联合应用2种重组细胞因子体外诱导获得猪骨髓源和血液源单核树突状细胞,为进一步研究猪树突状细胞与各种病原微生物作用奠定基础。