抗菌肽D基因转化广东桑的研究(初报)

采用前文[1]报道的广东桑转基因技术方法,由叶盘法将人工合成柞蚕抗菌肽D基因导入广东桑。抗菌肽基因由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)Ti质粒携带,对桑树叶盘进行感染和转化,并通过施加Km选择压力,经过诱导和分化,得到了Km~R表型的桑树转化苗。通过桑树叶片胭脂碱合成酶活性电泳检测及其DNA与α—~(32)P—dCTP标记的含抗菌肽基因的探针作点杂交,初步判断柞蚕抗菌肽D基因已在转化细胞中整合,为培育桑树抗青枯病品种奠定了基础。     

抗菌肽D基因导入柑桔及转基因植株的鉴定

由根癌农杆菌(Agrobaterium tumefaciens)的Ti质粒携带柞蚕抗菌肽D基因(122bp)感染红江橙外植体,经卡那霉素敏感性筛选及报告基因胭脂碱合成酶的电泳检测,获得若干转化苗;再经同位素标记的抗菌肽D基因为探针做点印迹杂交及Southern印迹杂交,均为阳性,证明抗菌肽D基因转化于红江橙幼苗获得成功。     

农杆菌携带柞蚕抗菌肽基因转入桑树的研究

人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因通过根癌农杆菌Ｔｉ质粒载体转入桑树叶盘，获得基因转化工程苗。柞蚕抗菌肽对桑树青枯病假单孢菌有明显杀菌作用。人工合成柞蚕抗菌肽基因导入农杆菌感染桑树叶盘并诱导成苗。经卡那霉素筛选，胭脂碱电泳检测及抗菌肽基因探针进行印迹点杂交，确认抗菌肽基因转化桑苗成功，为培育抗青枯病品种打下基础。     

抗菌肽生物工程及其应用

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能。根据其氨基酸序列设计、合成抗菌肽D及CAD基因,转化于作物,包括烟草、辣椒、马铃薯、水稻、桑树及柑桔等,已培育出抗病株系及品种。抗菌肽基因转化于酵母中表达,通过发酵生产重组抗菌肽,代替抗生素用作饲料添加剂饲喂肉鸡、仔猪及对虾,对预防疾病、提高存活率、增加体重及降低料肉比有较好效果,已经在生产中应用。用抗菌肽配制成口腔及阴道消毒洗涤剂,能预防呼吸道疾病及阴道炎症。用抗菌肽制剂与生长因子配制成多种化妆品,已投放市场,取得较好经济效益。     

T3代抗菌肽转基因辣椒的PCR检测及青枯病抗性测定

对T3代抗菌肽转基因辣椒的11个株系进行了PCR分子生物学检测，证明T3代抗菌肽转基因辣椒仍保持外源抗菌肽基因；对T3代转基因辣椒群体进行了抗枯病测定试验。转基因辣椒群体抗病力提高，表明在转基因辣椒中蚕抗菌肽D、B基因得到了有效表达，从而缓减了青枯病症状。     

柞蚕抗菌肽D基因在酵母中表达的研究

柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌功能，人工合成抗菌肽Ｄ基因（１２２ｂｐ）与含α－因子及前导肽序列的穿梭质粒ｐＣＬＷＡ２重组，克隆于酵母ＡＢ１０３。在缺亮氨酸的ＹＥ培养基中筛选Ｌｅｕ＋阳性的转化子。转化子菌株培养扩增后提取重组质粒与抗菌肽基因片段探针作点杂交为阳性，电泳后插入含抗菌肽Ｄ基因１２８ｂｐ的区带。在转基因酵母的发酵液中分离上清液，浓缩，对抗菌肽敏感的指示菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２Ｄ３１有明显抑菌效应。证实人工合成柞蚕抗菌肽Ｄ基因在酵母中表达。     

蚕抗菌肽研究与产业化35年的回顾和展望

1981年国内研究者首次从中国柞蚕(Antheraea pernyi)蛹血淋巴中分离出抗菌肽,测定其序列约37个氨基酸残基。之后又设计合成了柞蚕抗菌肽D、AD及CAD,并且在酿酒酵母、毕赤酵母及芽孢杆菌中得到高效表达,通过优化培养基配方及建立先进的发酵工艺流程后生产的蚕抗菌肽产品质量稳定。目前国内已有广东、河南、山东及湖北等省的多家生产蚕抗菌肽的企业,产品已应用于农业、养殖业、医药、食品、化妆品等领域。例如:蚕抗菌肽代替抗生素作为安全、无药物残留、不污染环境的绿色饲料添加剂用于饲养肉鸡、肉猪及对虾等,能有效预防疾病,提高成活率,增加体质量,降低料肉比;将蚕抗菌肽基因转化作物培育抗病品种,其中转入抗菌肽基因的抗青枯病辣椒品种已在广东、广西2个省(区)推广应用。今后需要进一步通过建立先进、高效的蛋白质重组技术和发酵工程技术,完善蚕抗菌肽产业化开发应用过程的相关标准、法规,努力推进蚕抗菌肽这一绿色生物制品发挥其潜在的巨大经济效益。     

转抗菌肽基因的柑桔遗传转化研究

柑桔是我国最重要的果树树种之一,绝大部分产区流行的柑桔溃疡病给柑桔业带来巨大的损失。柞蚕抗菌肽具有广谱杀菌能力,我们的预备试验表明,它对柑桔溃疡病病原菌Xanthomonas campestris pv.Citri有很强的抑菌效应,本文报道以柞蚕抗菌肽基因转化柑桔的一些结果。     

蚕抗菌肽的诱导及功能的研究

一、昆虫抗菌肽的诱导 1974年,瑞典Boman等首先发现将大肠杆菌注射于惜古比天蚕蛹,能诱导血淋巴产生具有广谱杀菌作用的抗菌肽。1981年,黄自然等报道注射大肠杆菌于滞育柞蚕蛹,诱导产生溶菌酶及抗菌肽。1982年,屈贤铭等分离了柞蚕抗菌肽的多个成员并分析了抗菌肽B及D的一级结构。同年,祁国荣等首次     

昆虫抗真菌肽Thanatin-CAD双价基因的合成、克隆及其表达

为促进昆虫抗菌肽基因在转基因抗病育种和生物工程制药的应用,通过设计嵌合引物结合分段PCR的方法将抗真菌肽Thanatin基因与Cecropin AD基因(CAD基因)融合拼接为Thanatin-CAD双价基因,采用T-A克隆法将其克隆至pGEM-T Easy载体,进行测序,结果证实与预期设计的完全一致;然后再将其亚克隆至表达载体pET-21d中,用IPTG诱导含重组表达质粒的菌株,对表达产物进行生物活性测定,初步结果显示Thanatin-CAD双价基因的融合表达产物对受试细菌无抑菌活性,但对部分病原真菌有较强的抑菌作用。     

家蚕和果蝇的抗菌肽cecropin B基因的原核表达及抑菌活性分析

动物抗菌肽天蚕素(cecropin)因具有抗菌谱广、活性较强、不易产生耐药性等特点而成为新型抗菌剂开发的材料。为了探讨通过原核表达的途径高效获取天然cecropin,以重叠PCR方法分别人工合成家蚕(Bombyx mori)和果蝇(Drosophilamelanogaster)的抗菌肽cecropin B基因(CecB2)并克隆至T载体,测序确认后分别克隆至pET-32a载体,转化至E.coli BL21(DE3)宿主菌进行表达。通过SDS-PAGE和Western blotting检测到2种目的蛋白均得到表达,但表达量存在差异,Bradford法测定纯化后的BmCecB2融合蛋白和DmCecB2融合蛋白的质量浓度分别为0.6、2.0 mg/mL。经Ni-NTA亲和层析纯化和透析处理后的2种产物的抗菌活性存在明显差异:DmCecB2和BmCecB2的质量浓度为10 mg/mL时,对E.coli DH5α的抑菌圈直径分别为15、8 mm左右,最小抑菌浓度分别为0.05、0.10 mg/mL。以上结果说明DmCecbB2的原核表达效率及表达产物的抑菌活性均明显高于BmCecB2。用生物信息学方法分析家蚕和果蝇的CecB2蛋白在结构上存在差异,这可能是导致2种产物活性不同的主要原因。     

致倦库蚊天蚕素CecB2基因的原核表达及蛋白纯化

构建致倦库蚊(贵阳株)天蚕素B2(CecB2)基因原核表达载体,并原核表达获得重组蛋白。定向克隆CecB2成熟肽序列至原核表达载体pET32a(+)上,将成功构建的pET32a-CecB2重组表达质粒转化大肠埃希菌Rosetta中经IPTG诱导表达,对IPTG诱导浓度和诱导时间优化后表达所得目的蛋白采用镍离子亲和层析纯化,SDS-PAGE和Western blot检测鉴定表达蛋白。结果表明,成功构建原核表达载体pET32a-CecB2,IPTG浓度和时间优化结果为IPTG浓度为0.05mmol/L,诱导时间为3h。SDS-PAGE检测获得大小约25ku的可溶性纯化蛋白,Western blot鉴定纯化蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生抗原抗体结合反应。说明所构建原核表达载体pET32a-CecB2能在大肠埃希菌中可溶表达,为进一步研究其生物学功能奠定了基础。     

柞蚕杀菌肽D对人直肠癌细胞的杀伤作用及机制

柞蚕杀菌肽D在0．05～200μg／mL浓度范围内对直肠癌细胞的生长有明显抑制作用；用氚标记的胸腺嘧啶核苷（3H-TdR）对癌细胞的掺入试验，发现能抑制细胞DNA的合成．导致3H-TdR掺入率明显下降。钙离子螯合剂Indo-1-AM能与癌细胞内钙离子螯合而产生特异性荧光，通过粘附细胞激光定量分析及筛选议的观察，发现杀菌肽能破坏细胞的钙离子通道，钙离子迅速逸出细胞外。采用电子显微镜观察直肠癌细胞超微结构的变化，发现杀菌肽首光破坏细胞膜致微绒毛收缩、融合，继而导致细胞器的破坏，最终细胞崩解死亡。正常猴肾细胞CV1，在1.00μg／mL浓度杀菌肽D作用48h，尚未发现不良影响。     

抗菌肽cecropin P1的研究进展

cecropin P1是一种哺乳动物抗菌肽,对G-菌及一些G 菌有抑制杀灭作用.本文就cecropin P1的结构、抗菌机理、抗菌活性、基因工程及其应用前景做一综述.     

天蚕素AD和蛙Buforin Ⅱ融合蛋白在大肠杆菌中的表达

本试验采用改良二步全基因合成法人工合成了含大肠杆菌偏爱密码子的天蚕素AD和蛙Buforin Ⅱ成熟片段的融合基因,并克隆至pMD18-T中,经测序确认正确后,与pET-Trx连接,构建了表达载体pET-Trx-CAD-Buforin Ⅱ,并在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达。表达产物占菌体总蛋白的35%,经羟胺裂解后对测试菌具有较好的杀菌效果,为进一步的开发与应用打下了基础。     

日粮中添加天蚕素抗菌肽对断奶仔猪生产性能和血液生化指标的影响

为考察天蚕素抗菌肽对断奶仔猪生产性能和血清生化指标的影响,选用28日龄、体重相近、健康的北京原种黑猪断奶仔猪192头,采用单因子设计,按体重相近、遗传基础相似的原则,完全随机分为4个处理组:对照组饲喂基础日粮,试验组在基础日粮基础上分别添加不同剂量的天蚕素抗菌肽(试验Ⅰ组:180 g/t,试验Ⅱ组:250 g/t,试验Ⅲ组:320 g/t)。每个处理组设三个重复,每个重复16头猪,试验期为32 d。试验结果表明:饲料中添加适量的天蚕素抗菌肽能够提高断奶仔猪平均日增重,但各组间差异不显著(P>0.05);显著降低料重比(P<0.05);提高血液中的免疫球蛋白含量。因此,在断奶仔猪基础日粮中添加适量天蚕素抗菌肽能提高断奶仔猪的生产性能和机体免疫性能,且本次试验中,天蚕素抗菌肽的最适添加量为320 g/t。     

Effects of Antibacterial Peptide Cecropin on Prouduction Performance，Immune Function and Serum Biological Parameters of Weaner Piglets

This experiment was conducted to study the effects of antimicrobial peptide cecropin on production performance,immune function and serum biological parameters of weaner piglets.A total of 240 weaner hybrid piglets （Landrace×Large White×Duroc） with average body weight （8.35±0.12）kg were randomly divided into 4 treatments with 6 replicates of 10 each.The four treatments were control group （fed a basal diet）,antibiotics group （fed basal diet＋140 mg/kg 50% kitasamycin＋100 mg/kg olaquindox ＋600 mg/kg 10% colistin sulfate）,antimicrobial peptide group （fed basal diet＋350 mg/kg antimicrobial peptide cecropin）,compatibility group （antibiotics + antibacterial peptide group）（fed basal diet＋250 mg/kg antimicrobial peptide cecropin＋50 mg/kg olaquindox ＋200 mg/kg 10% colistin sulfate）,each group was half male and half female.The pre-test period lasted for 7 days,the trial period lasted for 34 days.The results showed that compared with control group,the average daily gain in compatibility group was significantly increased （P＜0.05）,the average daily feed intake in antibiotic group and antimicrobial peptide group was significantly decreased （P＜0.05）,the feed conversion ratio and diarrhea rate in all three experimental groups were significantly decreased （P＜0.05）.The antibody blocking rate and serum IgG,IgA contents in antimicrobial peptide group and compatibility group were significantly increased （P＜0.05）,the serum urea nitrogen and blood sugar contents in antimicrobial peptide group and compatibility group were significantly decreased （P＜0.05）,but the serum total protein and albumin contents were significantly increased （P＜0.05）.In conclusion,dietary supplementation appropriate level of antimicrobial peptide cecropin could replace part of the antibiotics,and adding high dose of antimicrobial peptide cecropin could replace antibiotics used in feed completely.