基于转录组数据挖掘藏羊立毛肌发生的关键基因

旨在探究调控藏羊皮肤内立毛肌发生的分子机制，挖掘影响立毛肌发生的关键基因。本研究采集了30个75~110日龄健康情况良好的藏羊胚胎，收集背部皮肤组织，制作石蜡组织切片，利用HE染色观察背部皮肤内不同日龄立毛肌的形态学变化特征，推测出立毛肌发生的关键时期为胚龄75~85天（E75~E85）；分别挑选胚龄大约在75和85天各3个背部皮肤组织样品，分样品提取RNA，利用Illumina Hiseq平台进行转录组测序，对测序数据进行质控、过滤、比对，筛选得到差异表达基因，并对差异基因进行功能注释、富集分析、蛋白网络互作和RT-qPCR验证，挖掘调控立毛肌早期发育的关键候选基因。测序结果共得到1 159个差异表达的基因（P<0.05），其中900个基因上调，259个基因下调。随机选择6个差异表达的基因进行RT-qPCR验证，表达趋势与转录组测序结果一致，表明测序结果可靠。通过对差异基因进行GO功能注释和KEGG富集分析，筛选到与立毛肌发育相关的5个生物学过程条目和5个信号通路共47个非冗余基因（如BAMBI、TNNI3、HOXA9等）。本研究表明，藏羊立毛肌开始发育的关键时期约为E75~E85天，该时期内SPP1、BAMBI、TNNI3、HOXA9、SOX15可能为影响藏羊立毛肌发生的关键候选基因。     

羊毛弯曲及毛囊发育相关生物学机制研究进展

羊毛弯曲是影响羊毛品质高低的关键因素之一，毛股弯曲的减少以及毛股由紧实变得蓬松会导致羊毛品质下降，从而影响皮毛价值。毛囊是调控毛发生长的皮肤附属器官，对于毛发弯曲形状的形成具有重要作用。近年来，有关羊、小鼠等动物毛发纤维弯曲形成的相关研究以及毛囊发育调控等取得了一定进展。本文介绍了羊毛纤维结构的特点，阐述了毛囊发育相关重要调控信号通路及其对毛发弯曲的影响，最后，基于羊毛弯曲相关的基因和蛋白的研究进展进行综述。通过对羊毛弯曲及毛囊发育相关生物学机制进行总结，以期对羊毛弯曲及毛囊发育的相关分子机制的研究提供理论依据，同时也对改良羊毛弯曲性状的工作提供一些参考。     

羊毛弯曲及毛囊发育相关生物学机制研究进展

羊毛弯曲是影响羊毛品质高低的关键因素之一,毛股弯曲的减少以及毛股由紧实变得蓬松会导致羊毛品质下降,从而影响皮毛价值。毛囊是调控毛发生长的皮肤附属器官,对于毛发弯曲形状的形成具有重要作用。近年来,有关羊、小鼠等动物毛发纤维弯曲形成的相关研究以及毛囊发育调控等取得了一定进展。本文介绍了羊毛纤维结构的特点,阐述了毛囊发育相关重要调控信号通路及其对毛发弯曲的影响,最后,基于羊毛弯曲相关的基因和蛋白的研究进展进行综述。通过对羊毛弯曲及毛囊发育相关生物学机制进行总结,以期对羊毛弯曲及毛囊发育的相关分子机制的研究提供理论依据,同时也对改良羊毛弯曲性状的工作提供一些参考。     

绵羊FGF10基因克隆、序列分析及其在毛囊发育中的表达分析

本试验旨在获得中国美利奴羊成纤维细胞生长因子10（fibroblast growth factor 10，FGF10）基因的编码区（CDS）全长序列并进行生物信息学分析，随后对FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达特征进行分析，明确其在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达模式，为进一步研究FGF10 mRNA表达水平与中国美利奴羊毛囊生长发育的表达调控机制奠定理论基础。采用PCR扩增获得中国美利奴羊FGF10基因CDS，并克隆到zero PCR@^TM-Blunt进行测序验证；利用实时荧光定量PCR技术检测FGF10在中国美利奴羊毛囊发育过程中的表达差异。结果表明，绵羊FGF10基因CDS长度为696 bp（序列上传GenBank，获得登录号：MT872422），编码231个氨基酸，与牛和山羊的氨基酸序列同源性达100%，存在1个信号肽和1个跨膜结构域，其为分泌通路信号蛋白；实时荧光定量PCR分析表明，FGF10基因在中国美利奴羊毛囊发育过程中均表达，在毛囊发育第85天表达最高，显著高于其他毛囊发育时期（P<0.05）。本研究获得中国美利奴羊FGF10基因完整的编码区序列和毛囊发育过程中的表达特征，生物信息学分析发现，FGF10基因编码区序列具有物种间的保守性，同时FGF10在绵羊毛囊不同发育阶段的皮肤组织中表达，由此表明，FGF10基因可能在绵羊毛囊的生长发育过程中发挥重要的生物学作用。     

山羊毛乳头细胞分离鉴定及TGF-β/smad通路相关基因的表达

试验旨在分离山羊毛乳头细胞,并探索其中TGF-β/smad通路相关基因的表达,为体外开展山羊毛囊发育的相关机制研究提供良好模型。采用中性蛋白酶与胶原酶两步消化法对山羊背部皮肤做处理,在体视显微镜下分离毛乳头细胞并进行纯化。细胞免疫荧光和Western blotting验证平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和波形蛋白（vimentin,VIM）在体外培养的毛乳头细胞中的表达,并检测TGF-β/smad通路中相关基因在山羊毛乳头细胞中的表达情况。结果显示,分离后进行贴壁培养的毛乳头细胞生长较慢,在分离15 d后具有成熟形态,可进行传代培养。细胞免疫荧光和Western blotting结果表明,α-SMA和VIM在体外培养的毛乳头细胞中均表达,TGF-β/smad通路中smad4、smad5基因的表达水平显著高于对照组（P<0.05）,smad2、smad6、smad7基因的表达量极显著高于对照组（P<0.01）,这些与毛囊发育相关的关键基因均呈现高表达,表明毛乳头细胞可能通过TGF-β/smad通路的调控从而影响毛囊的发育。本研究成功分离出山羊毛乳头细胞,为体外研究山羊毛囊发育机制奠定良好的理论基础和细胞模型。     

利用加权基因共表达网络分析筛选天农麻鸡胴体性状候选基因

旨在通过转录组测序(RNA-Seq)与加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis,WGCNA)筛选慢速型黄羽肉鸡天农麻鸡胴体性状相关候选基因。本研究以104只天农麻鸡为素材,在126日龄时进行屠宰,测定胸肌重等7个胴体性状,采集胸肌组织进行RNA-Seq。基于RNA-Seq数据获得基因表达矩阵后,结合表型进行WGCNA分析,确定目标模块,筛选目标模块的枢纽基因,并分别进行KEGG通路富集、蛋白质互作网络(protein-protein interaction network,PPI)构建和相关性分析。104份胸肌组织RNA-Seq质控后获得15 092个基因的表达量。与胴体表型进行WGCNA,共得到19个模块,其中4个模块与胴体性状极显著相关。功能富集结果表明,目标模块内基因主要富集在ECM-受体相互作用、黏着力等通路。以|Module membership|> 0.8、|Gene significance|> 0.2为标准筛选到58个枢纽基因,并通过PPI网络构建鉴定到5个网络节点基因,整合相关性分析确定COL1A2和SPARC为最重要候选基因。本研究通过大样本量转录组分析,发现ECM-受体相互作用等通路在天农麻鸡胴体性状调控中发挥主要作用,筛选到COL1A2和SPARC是影响全净膛率性状的重要候选基因,研究结果为鉴定选育分子标记,解析胴体性状分子机制奠定理论基础,为慢速型黄羽肉鸡育种提供重要参考。     

新吉细毛羊角蛋白的EST筛选及表达研究

试验旨在从新吉细毛羊皮肤组织表达序列标签(expressed sequence tags,ESTs)中筛选与毛囊发育相关基因并探讨其表达模式与羊毛细度的相关性。利用组装、比对软件Trinity与Blat对新吉细毛羊皮肤组织ESTs组装、注释进而筛选与毛囊发育相关基因,并通过实时荧光定量PCR相对定量方法以2^-△△Ct值检测相关基因在不同绵羊个体中的表达规律。结果显示,从474条ESTs中筛选注释获得了4个与毛囊发育相关的角蛋白基因KRT27、KAP3.2、KAP11.1和KAP8.1;4个角蛋白基因在超细型细毛羊皮肤组织表达量极显著高于细型细毛羊的表达量(P<0.01);4个角蛋白基因表达量:KRT27 >KAP3.2 >KAP11.1 >KAP8.1。该研究为角蛋白基因在细毛羊转录水平上的研究提供了一定数据。     

中卫山羊羊毛弯曲的表型分析

波浪弯曲是中卫山羊沙毛皮的主要特征。为研究中卫山羊波浪弯曲的生长发育规律,采集1日龄和35日龄羊毛,测定其弯曲数、自然长度、伸直长度3个性状表型。结果表明:中卫山羊1日龄羊毛弯曲数3.32个,自然长度3.87 cm,伸直长度5.05 cm;35日龄羊毛的相应数据分别为4.65个,7.46 cm,9.71 cm;35日龄羊毛弯曲部分伸直长度7.45 cm,根部非弯曲部分长度2.26 cm。分析发现,性别对35日龄羊毛弯曲数无影响(P0.05),但对1日龄羊毛弯曲长度和伸直长度有显著影响(P0.05),公羔均极显著地长于母羔(P0.01);羊毛波浪弯曲从胎儿期随日龄增长而生长,在生后17.5 d时,弯曲开始变直,这为进一步研究羊毛弯曲的生长发育机制提供了依据。     

羊毛及动物毛发弯曲形成的生物学机理研究进展

弯曲是羊毛纤维的一个特征,对加工过程和最终的毛纺织品特性有显著影响。羊毛弯曲与毛囊中细胞的不对称分裂、毛纤维中正副皮质的双边排列、不同角蛋白的不对称组成及角质化过程等相关。尽管羊毛弯曲形成的分子机理鲜有报道,但小鼠锯齿状及波纹状毛发分子调控机理研究表明,IGFBP5/Krox20、Eda/Edar、Wnt、EGFR/TGF-α、Msx2/Foxn1/Ha3等介导的信号通路及毛发角蛋白基因和一些转录因子对纤维弯曲形成有重要影响。皮肤基因表达模式比较分析表明,哺乳动物毛发产生和发育的分子调控机理是相似的。这些信息为研究羊毛弯曲形成的分子机理提供了可能。本文旨在对羊毛及小鼠等动物毛发弯曲形成机理进行综述,为进一步解析羊毛弯曲形成分子机理进而为改善羊毛弯曲性状的研究提供参考。     

HGTP基因与羊毛细度的相关性分析及其启动子活性研究

本研究旨在构建高甘氨酸－酪氨酸蛋白（HGTP）启动子荧光素酶报告基因载体并验证其活性,阐明HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤毛囊组织中的表达差异与羊毛经济性状的关系。运用PCR方法扩增HGTP基因启动子序列片段,克隆至pGL3-Basic载体中构建重组质粒,并通过双酶切验证和测定核酸序列鉴定;转染皮肤成纤维细胞并检测报告基因的活性;测定羊毛的纤维直径、长度的数据,利用实时荧光定量PCR分析HGTP基因在不同品种绵羊的皮肤毛囊组织中的表达情况。结果显示,萨福克羊与中国美利奴羊的羊毛纤维直径及自然长度差异极显著（P<0.01）,HGTP基因表达水平与羊毛纤维直径存在极显著的高度正相关（P<0.01）,与羊毛自然长度呈现显著的中等负相关（P<0.05）,而羊毛直径与自然长度之间存在极显著的高度负相关（P<0.01）。HGTP基因在萨福克羊和中国美利奴羊皮肤组织中的表达水平差异极显著（P<0.01）。启动子活性荧光素酶检测结果显示,KAP6.1、KAP7和KAP8.1启动子元件在绵羊皮肤成纤维细胞和3T3细胞中均有表达,且在绵羊成纤维细胞中的活性极显著高于在3T3细胞中的活性（P<0.01）。HGTP基因可以作为研究羊毛纤维直径、自然长度的候选基因。构建不同长度的表达载体,转染皮肤成纤维细胞,获得的2个启动子元件都能驱动外源基因在体外细胞水平表达。绵羊HGTP基因启动子的功能研究为调控羊毛发育提供了理论依据。     

羊胎儿期皮肤毛囊发育及调控机制的研究概述

中国绵山羊养殖历史悠久,品种资源丰富,在国民经济中起重要作用。羊毛按纤维类型可分为同质毛和异质毛,同质毛的特点是被毛由同一类型的羊毛纤维组成,其特点是羊毛的纤维直径、长度、卷曲等外表特征基本相同,异质毛的特点是被毛中兼有绒毛、有髓毛、无卷曲和少卷毛等不同类型的羊毛纤维,其化学、物理性能均不相同。毛囊是控制哺乳动物被毛生长的重要器官,是唯一具有周期性发育并可终生再生的器官,控制着被毛发生发育与自然脱落。毛囊依据其形成时间和结构可分为初级毛囊(primary follicles)和次级毛囊(secondary follicles),初级毛囊生长髓质发达的粗毛,次级毛囊产生无髓毛的绒毛。有髓毛较粗长且弯曲少,多用于加工粗纺织品、毛毯、地毯、毡制品;无髓毛直径一般不超40 μm,弯曲多,是毛纺工业的优质原料。毛囊的发育受到不同信号通路和基因的影响,如Wnt信号通路、骨形态发生蛋白质(BMP)信号通路、成纤维细胞生长因子(FGF)信号通路、音猬因子(SHH)信号通路、Notch信号通路等以及角蛋白家族基因、BMPs家族基因、同源异型盒基因(Hox)等。作者对国内外对绵山羊胎儿期皮肤毛囊发育及调控机制进行综述,以期为提高以绵山羊被毛产量及改善被毛品质为主要育种目标的选育提供参考。     

基于WGCNA技术研究驴肉嫩度基因及代谢物调控网络

旨在通过WGCNA技术解析转录组和代谢组数据，探究驴肉嫩度调控机制。试验动物采用24~36月龄的健康雌性广灵驴（平均体重236.10 kg），将驴肉剪切力和肌内脂肪含量作为表型数据，以每个样品3个重复进行表型数据测定。本试验基于前期研究的具有显著剪切力和肌内脂肪含量差异的14个广灵驴背最长肌样本的转录组和代谢组测序数据，运用WGCNA技术筛选与驴肉嫩度相关的基因及代谢物并进行转录组与代谢组联合分析，解析嫩度相关基因与代谢物。结果表明，利用WGCNA技术通过|r|≥0.5以及P≤0.05筛选标准得到3个与嫩度相关的关键基因模块Greenyellow、Darkgrey、Darkgreen以及2个关键代谢物模块Brown、Yellow。对关键基因模块进行GO富集分析发现，模块内基因主要在甘油磷脂的生物合成、脂质氧化、脂肪酸β-氧化、细胞大分子分解代谢过程、肌肉器官发育、钙离子结合等GO功能上富集。存在于关键模块内的基因及代谢物经KEGG功能富集分析发现，其大多集中在精氨酸和脯氨酸代谢、Wnt信号通路、蛋白质消化吸收、脂肪酸代谢、TCA循环、胰高血糖素信号通路、甘油磷脂代谢、嘌呤代谢、β-丙氨酸代谢等通路上。联合分析表明，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢以及PPAR信号通路可能调控驴肉嫩度。WGCNA及联合KEGG共富集分析筛选到的丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢、精氨酸和脯氨酸代谢、β-丙氨酸代谢以及PPAR信号通路可能对调控驴肉嫩度有重要作用；而GAD1、PPAT、NIT2、AGMAT、CARNS1、ACOXL以及腺苷酸基琥珀酸、L-脯氨酸、L-谷氨酸、肌酸、高肌肽、肌肽、泛酸、（9S）-羟基十八碳二烯酸则可能是影响驴肉嫩度的候选基因及代谢物。本试验可为今后广灵驴肉质嫩度的分子调控与改良育种提供一定的理论基础。     

基于单细胞转录组测序技术对鄂尔多斯细毛羊次级毛囊形态发生诱导期的研究

【目的】 试验旨在解析鄂尔多斯细毛羊胚胎期次级毛囊诱导期形态发生过程中主要细胞类型的分子特征和分化过程。【方法】 对采集的3只鄂尔多斯细毛羊（胎龄87 d）体侧部（肩胛骨后缘处）的皮肤样本进行HE染色，鉴定毛囊的发育时期；部分皮肤样本经过混样后进行单细胞转录组测序（scRNA-Seq），应用t-分布随机近邻嵌入（tSNE）分析细胞簇，分别使用胶原Ⅰ型α1链（Col1a1）和角蛋白15（Krt15）鉴定真皮谱系细胞和表皮谱系细胞，并使用皮肤组织不同细胞的标记基因进行细胞类型分析；对测序数据进行拟时序分析，探究其分化过程中差异基因的表达；通过GO功能富集分析进一步验证基因的功能。【结果】 HE染色结果发现，鄂尔多斯细毛羊在胎龄87 d处于次级毛囊诱导期。通过scRNA-Seq在胎龄87 d的细毛羊体侧部皮肤细胞样品中获得10 603个细胞和18 704个基因的scRNA-Seq数据可用于下游分析。tSNE分析发现，皮肤组织中共有15个细胞簇；Col1a1和Krt15标记基因鉴定表明，真皮细胞和表皮细胞具有高度异质性。拟时序分析构建毛囊形态发生过程中真皮/表皮细胞谱系细胞的分化轨迹和基因动态表达图谱表明，在真皮谱系细胞由成纤维细胞（Fb）向成熟真皮聚凝物（DC）的分化过程中，多个不同阶段的标记基因FST重组蛋白（Fst）、抑制素亚基βα（Inhba）和转录阻遏物GATA结合1（Trps1）均在拟时序轨道上特异性表达，并富集了Wnt、Noggin和骨形态发生蛋白（BMP）等与毛囊形态发生相关的信号通路；在表皮谱系细胞分化过程中，基质和毛囊间表皮（IFE）的标记基因角蛋白10（Krt10）、同源基因C13（HOXC13）和音猬因子信号（SHH）在表皮谱系细胞拟时序轨道的2个分支上均特异性表达，且富集在细胞增殖和细胞黏附等相关通路。【结论】 在细毛羊次级毛囊诱导期，真皮谱系细胞由成纤维细胞分化至真皮聚凝物，表皮谱系细胞处于基质和毛囊间表皮细胞增殖分化阶段，结果可加深人们对细毛羊次级毛囊形态发生过程的了解，为鄂尔多斯细毛羊育种研究提供有力的理论和技术支持。     

Identification of Key Genes of Mammary Gland Development from Pregnancy to Lactation in Dairy Goats by WGCNA

The purpose of this study was to select the key genes of mammary gland development at different physiological stages in dairy goats by weighted gene co-expression network analysis(WGCNA). GSE14008 mammary gland tissue microarray data set of dairy goats at different physiological stages (pregnancy 46 days, 70 days, 90 days, 110 days and 40 days postpartum) was downloaded from GEO database, and co-expression analysis was carried out using WGCNA package of R language. The target modules were selected by correlation analysis between the modules and physiological stages, and the hub genes were selected according to the connectivity degree. After enrichment analysis of the modules using DAVID website, the protein-protein interaction network of the modules was constructed using String website and the core genes were obtained using Cytoscape software, and finally the target genes were obtained from intersection of core genes and hub genes. A total of 8 443 genes from 18 samples were analyzed for co-expression of weighted genes. The 30 modules were obtained, and 4 target modules related to different physiological stages and 30 hub genes of each module were selected. Meanwhile, protein-protein interaction network of 4 modules and 20 core genes of each network were also obtained. Finally, 13 target genes related to mammary gland development were obtained from the 4 modules, which were UQCR, RGL2, NOTCH1, PTBP1, PPP5C, FZR1, UBE2L3, TNF, MAT2A, ITGB2, GPR18, JAK1 and CSN2 genes. The key processes of mammary gland development at different physiological stages and the genes that played the key role in these processes were elucidated by WGCNA, GO enrichment analysis, PPI network and other bioinformatics techniques, which provided a new idea and clue for the further research on the mechanism of mammary gland development.     

WGCNA鉴定奶山羊妊娠至泌乳期乳腺发育关键基因

旨在通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）筛选奶山羊不同生理阶段乳腺发育的关键基因。本研究从GEO数据库中下载奶山羊不同生理阶段（妊娠46天、70天、90天、110天和产后40天）的乳腺组织微阵列数据集GSE14008，使用R语言的WGCNA包对数据进行共表达分析。将得到的模块与生理阶段进行关联分析，选择目标模块，并根据连接度选出枢纽基因。使用DAVID网站对模块进行富集分析后，使用String网站构建模块的蛋白互作网络，并使用Cytoscape软件得到核心基因，最终与枢纽基因取交集得到目标基因。对18个样本的8 443个基因进行加权基因共表达分析，得到30个模块，并选出4个与不同生理阶段相关的目标模块及每个模块的30个枢纽基因，同时也得到4个模块的蛋白互作网络及每个网络的20个核心基因。最终，4个模块共得到13个与乳腺发育相关的目标基因（UQCR、RGL2、NOTCH1、PTBP1、PPP5C、FZR1、UBE2L3、TNF、MAT2A、ITGB2、GPR18、JAK1、CSN2）。本研究通过WGCNA、GO富集分析和PPI网络等生物信息学技术，阐明了不同生理时期乳腺发育的关键过程，及在这些过程中起关键作用的基因，这为进一步研究乳腺发育机制提供了新的思路和线索。     

Isolation and Identification of Goat Dermal Papilla Cells and Expression of TGF/β-smad Pathway Related Genes

The purpose of this study was to isolate goat hair follicle cells,and to explore the expression of TGF-β/smad pathway-related genes,providing a good model for the research on the mechanism of goat hair follicle development in vitro.In this study,two steps of neutral protease and collagenase digestion were used to treat the skin on the back of goats,the hair follicle cells were isolated and purified under stereomicroscope.Cellular immunofluorescence and Western blotting method were used to verify the expression of α-SMA (α-smooth muscle actin,α-SMA) and VIM (vimentin,VIM),and the expression of related genes of the TGF-β/smad pathway in goat hair papilla cells were examined.The results showed that the isolated goat hair follicle cells in adherent culture after separation grew slowly and had mature morphology after 15 days of separation and could be subcultured.The results of immunofluorescence and Western blotting showed that both α-SMA and VIM were positive in vitro cultured hair papilla cells.The expression of smad4 and smad5 genes in the TGF-β/smad pathway were significantly higher than those in control group (P<0.05),and the expression of smad2,smad6,and smad7 were extremely significantly higher than those in control group (P<0.01).These key genes related to hair follicle development were highly expressed.This study successfully isolated goat dermal papilla cells,which would give a good theoretical basis and cell model for studying the hair follicle development mechanism in vitro.