单一血清稀释度ELISA定量检测鸡新城疫抗体水平的研究

建立了—种以单一血清稀释度定量检测鸡血清中 NDV抗体的间接 ELISA 方法,经试验得出回归方程 LnET=5.878 0.537P/N。该方法特异性强,能被 NDV 单抗所特异性阻断,比 HI 方法敏感。通过对 SPF 鸡等进行的不同疫苗免疫前、后抗体动态测定表明,ET 值与 HI 值之间呈一定的相关性(r=0.8702),强毒攻击试验表明,ET值>4000时鸡群能得以保护,装配成的商品试剂盒保存期长达6个月.     

NDVLaSota、V4疫苗免疫鸡及免疫攻毒鸡的主要特异性血清抗体动态变化规律比较

本研究应用间接ELISA方法对新城疫LaSota和V4疫苗免疫SPF鸡及免疫后攻毒SPF鸡的血清中新城疫病毒（NDV）特异性HI抗体、IgM和IgG抗体水平的动态变化进行了检测。结果表明，V4较LaSota疫苗免疫鸡HI抗体提前3天左右出现，但除高峰期（1周左右）外，其HI抗体水平均低于LaSota免疫鸡。LaSota免疫鸡。LaSota疫羁免疫鸡血清中NDV特异性IgM和IgGr抗体高峰较V4免疫鸡提前约2周出现，攻毒后，LaSota免疫鸡血清中特异性IgG和IgG回忆应答显著，而V4免疫鸡IgM和IgG回忆应答不明显。     

新城疫病毒HN特异性多肽抗体间接ELISA方法的建立

为建立快速检测新城疫病毒抗体的血清学方法,通过合成NDV主要保护性抗原HN蛋白和F蛋白上的特异性表位多肽,将其与BSA载体蛋白偶联,作为包被抗原,建立检测NDV抗体的间接ELISA方法。并对其进行敏感性、特异性、与HI方法阴阳性符合率检测。结果显示:基于"PDEQDYQIRMAKSSYKPGRFGGKRIQQAILS"多肽的该ELISA方法与其他鸡主要传染病阳性血清无交叉反应,具有良好的特异性。通过对112份临床鸡血清样品进行检测,该方法的敏感性为94.0%、特异性为100%,与HI方法检测的阴阳性符合率为96.4%。研究表明,建立的ELISA方法对血清中NDV的抗体水平检测具有较高的灵敏度和很好的特异性,可为ND疫苗免疫后抗体水平的检测和监测提供可靠工具。     

间接ELISA检测禽流感抗体方法的建立

应用醛化的鸡红细胞经吸附释放方法获得纯化的禽流感病毒 (AIV) ,经 triton X-1 0 0处理并反复冻融制备禽流感 EL ISA抗原。应用抗鸡 Ig轻链单抗 1 B7辣根过氧化物酶结合物建立了定量检测禽流感抗体水平的 EL ISA方法。确立了将鸡血清 1 0 0倍稀释监测 EL ISA效价(ET)的回归方程 y=0 .77452 x 0 .8793 5(r=0 .9466) ,可用于定量测定。血凝抑制 (HI)抗体与 EL ISA方法的比较试验表明 ,EL ISA法比血凝抑制试验敏感 1 .5倍以上     

鸡新城疫基础低抗体与基础高抗体免疫效果研究

鸡新城疫(ND)是由副粘病毒属的新城疫病毒(NDV)引起的一种严重危害养鸡生产的烈性传染病.鸡新城疫微量血清凝集抑制试验(微量HI试验)结果与鸡对NDV的抵抗力有正相关性,目前大都使用微量HI试验测定鸡血清中ND抗体水平.     

鸡新城疫琼脂扩散试验方法的研究

用新城疫病毒(NDV)La Sota株接种的鸡胚含毒尿囊液,经灭活、透析和浓缩后,研制出琼脂扩散(AGP)抗原。应用AGP和HI试验同步检测不同免疫状态的鸡血清样品977份。试验表明,HI抗体效价≥16的被检血清,AGP阳性率为98.5％(268/272);HI抗体效价=8的,AGP阳性率为79.3％(142/179);HI抗体效价≤4的526份血清,AGP试验均为阴性。抗原经2次冻融,或在4℃和-3℃保存10个月以上,其效价未见降低。AGP抗原可用于ND的免疫监测和流行病学调查。     

不同病毒在SPF鸡胚与普通鸡胚繁殖性能的比较

利用HI和AGP方法检测普通种蛋中ND和IBD的卵黄抗体水平,利用HA和EID50检测方法比较多种病毒(如NDV、IBV、IBDV及AEV)在SPF鸡胚与普通鸡胚上繁殖性能的差异。研究结果表明:普通种蛋中ND及IBD的卵黄抗体水平普遍较高,在SPF鸡胚上新城疫LaSota病毒繁殖量是普通鸡胚的5～20倍,尿囊液血凝效价平均高2.0～2.5滴度。MA5毒株在SPF胚病毒液EID50为普通鸡胚的10倍以上熏且每次检测的结果比较接近。IBDV、AEV等病毒在普通鸡胚上几乎不能增殖。     

不同病毒在SPF鸡胚与普通鸡胚繁殖性能的比较

利用HI和AGP方法检测普通种蛋中ND和IBD的卵黄抗体水平，利用HA和EID50检测方法比较多种病毒(如NDV、IBV、IBDV及AEV)在SPF鸡胚与普通鸡胚上繁殖性能的差异。研究结果表明：普通种蛋中ND及IBD的卵黄抗体水平普遍较高，在SPF鸡胚上新城疫La Sota病毒繁殖量是普通鸡胚的5～20倍，尿囊液血凝效价平均高2.0～2.5滴度。MA5毒株在SPF胚病毒液EID50为普通鸡胚的10倍以上，且每次检测的结果比较接近。IBDV、AEV等病毒在普通鸡胚上几乎不能增殖。     

ELISA 检测新城疫病毒抗体

用鸡红细胞凝集解脱法提纯的新城疫病毒(NDV)抗原包被酶标板,最适抗原浓度为0.1μg～8μg/孔;鸡血清的最适稀释倍数为1:400.该抗原与马立克氏病等七种禽病抗血清不发生交叉反应.与血凝抑制试验(HI)比较.在检测的233份血清样本中,ELISA 阳性124份(占53%);HI 效价1:8以上者为84份(占36%);84份 HI 阳性样品,ELISA 亦为阳性;40份 HI 阴性样品,ELISA却为阳性;没有 ELISA 阴性而 HI 阳性的样本.两法可追求检测结果一致的为193/233(占83%).     

抗新城疫多肽的特异性抗体被动免疫的保护作用

本试验研究了抗新城疫(ND)多肽的特异性抗体在鸡的被动免疫中的作用.将6组3周龄的鸡,分别以血凝素神经氨酸酶/融合蛋白(NH/F),核蛋白/磷蛋白(NP/P),基质蛋白(M)和NDV所有蛋白(ALL)的复合物,及紫外线致弱的NDV(UVNDV)和阴性血清进行免疫,在免疫后的2天采集血样,并攻击Texas GB NDV,利用间接血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验(VN)检测出在HN/F、所有的蛋白和UVNDV免疫组存在着抗体.在NP/P和M蛋白免疫的鸡中的抗体只有用ELISA才能检测出来,在免疫血清注射后的2天抗体效价下降2个指数.用HN/F、所有蛋白、UVNDV抗血清免疫的鸡可以抵抗强毒的攻击,而那些用NP/P、M蛋白和阴性血清免疫的鸡有ND的临床症状.在所有免疫鸡气管中分离的病毒都可以复壮,机体中存在的特异性抗体可以保护鸡抵抗强毒的攻击,但不能阻止鸡排毒.     

间接ELISA检测禽霍乱抗体方法的建立

用多杀性巴氏杆菌 TJ8菌株制备ELISA抗原 ,与抗鸡 Ig单抗 1 B7酶结合物建立了检测鸡血清抗体水平的间接 ELISA方法。交叉试验、阻断试验、重复性试验等表明该方法重复性好、特异性强 ,灵敏度高。确立了将鸡血清 1 0 0倍稀释监测 ELISA效价(ET)的回归方程 y=1 .4981 + 0 .391 9x(P>0 .0 5 ) ,可用于定量测定。间接凝集试验与ELISA方法的比较试验表明 ,EL ISA法比间接血凝试验敏感性高 4倍以上     

检测鸡慢性呼吸道病抗体ELISA方法的建立

用败血支原体（ＭＧ）Ａ５９６９株制备ＥＬＩＳＡ抗原,与抗鸡ＩＧ单抗ＩＢ７酶结合物建立了检测鸡血清抗体水平的间接ＥＬＩＳＡ方法,交叉试验、阻断试验、重复性试验等表明该方法重复性好、特异性强、灵敏度高。确立了将鸡血清６４倍稀释监测ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ）的回收方程ｙ＝１．３８３＋０．２２４ｘ,可用于定量测定,血凝抑制试验（ＨＩ）与ＥＬＩＳＡ比较试验表明,ＥＬＩＳＡ法比ＨＩ试验敏感性高４倍以上。     

应用单克隆抗体酶联免疫斑点试验检测抗传染性喉气管炎抗体

本文提出以硝酸纤维膜作为固相载体，辣根过氧化物酶标记的抗传染性喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）的单克隆抗体（ＭｃＡｂ），邻苯二胺为底物，检测ＩＬＴＶ抗体的免疫斑点试验方法（Ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ）。该方法较常规方法敏感，特异、省时。该方法的建立为鸡群疫病监测，免疫鸡群抗体水平的检测提供了新的可靠方法。     

异源抗原在建立ELISA检测传染性法氏囊病毒抗体中的应用

本文报告采用ｖｅｒｏ细胞增殖的ＩＢＤＶ抗原建立了间接酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ），用于定量检测鸡传染性法氏囊病毒（ＩＢＤＶ）抗体。该法快速、敏感性高、特异性强、重复性好。同时，通过３０份血清样品ＥＬＩＳＡ效价（ＥＴ）的对数值（ｌｏｇＥＴ）与血清Ｐ／Ｎ值（待检血清ＯＤ值与阴性血清ＯＤ值之比）的线性回归分析，得直线方程ｙ＝３．０５８９＋０．０７３９ｘ（ｒ＝０．９１７４），从而血清样品的ＥＴ可通过血清单一稀释度的Ｐ／Ｎ值来计算。用不同来源抗原作ＥＬＩＳＡ表明，从ｖｅｒｏ细胞增殖的抗原比从鸡胚成纤维（ＣＥＦ）细胞增殖的抗原可提高检测血清ＯＤ值近２０％，表现出异源抗原具有更高的特异性     

鸡传染性支气管炎ELISA抗体检测试剂盒的研制

采用加蔗糖垫离心纯化鸡传染性支气管炎病毒(IBV)制备抗原，用提纯的IBV抗原包被微量板，建立了检测鸡传染性支气管炎(IB)抗体的ELISA试剂盒。抗原、被检血清和酶标结合物的最佳工作浓度分别为10ug／ml、1：200和1：3200。与IDEXX试剂盒相比，其敏感性、重复性、特异性均接近国外同类产品水平。对SPF鸡血清、实验免疫与攻毒的SPF鸡血清进行检测，结果表明所建立的ELISA特异性为95．6％，与IDEXX试剂盒符合率为95．6％。用于检测抗IBV特异性IgG抗体发现在免疫接种IB弱毒苗后，第4天即可检测到IgG抗体，峰值在第3周。试验鸡在通过滴鼻、点眼途径人工感染IBV强毒后，第5天抗体滴度明显上升。我们认为，该法是目前我国SPF鸡质量监测、养鸡生产中进行IB监测较好的方法。     

牛传染性鼻气管炎病毒单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)血清抗体的阻断ELISA方法,本研究以经蔗糖密度梯度离心法纯化的IBRV作为免疫原制备1株单克隆抗体(MAb),命名为cp-1-1。经间接ELISA、IFA和western blot鉴定,该MAb与IBRV呈阳性反应,与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)及牛副流感病毒3型(BPIV3)呈阴性反应,具有较强的特异性。质谱分析结果显示MAb cp-1-1识别的表位位于IBRV VP8蛋白。以纯化的IBRV作为包被抗原、MAb cp-1-1作为检测抗体,建立检测IBRV血清抗体的阻断ELISA方法。该检测方法的抗原包被量为0.89μg/孔,样品稀释度为12,检测抗体MAb量为1.3μg/孔,二抗稀释度为15000。利用50份IBRV抗体呈弱阳性的牛血清(中和抗体效价为14~116)作为标准参考血清,确定该检测方法的阻断率Cut Off值为52.06%,即阻断率高于52.06%时判为阳性,低于52.06%时判为阴性。阻断ELISA方法特异性试验显示仅IBRV阳性血清检测为阳性,而BVDV、BPIV3、牛腺病毒3型(BADV-3)和O型口蹄疫病毒(O-FMDV)阳性牛血清均检测为阴性,表明该方法具有较强的特异性;该方法可检测的最低中和抗体效价为14,与病毒中和试验的敏感性一致,表明该方法具有较高的敏感性;重复性试验显示该方法批内、批间变异系数均小于10%,显示较好的重复性。对130份现地牛血清检测结果显示,该方法与病毒中和试验的符合率为98.46%。用该方法对某牛场接种IBRV灭活疫苗的牛血清进行检测,抗体阳性率为99.51%(205/206)。另外,采用该方法对我国8个省(市、自治区)的801份牛血清进行检测,IBRV的抗体阳性率为41.6%(333/801)。本研究建立的阻断ELISA方法可以用于IBRV疫苗免疫监测和血清流行病学调查,为我国IBR的防控提供技术支持。     

Detection of avian leukosis virus antigens by the ELISA and its use for detecting infectious virus after cultivation of samples and partial characterization of specific pathogen-free chicken lines maintained in this laboratory.

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for detecting avian leukosis virus (ALV) antigens was developed with rabbit anti-ALV serum. The ELISA detected purified ALV of subgroups A and B at a concentration of 0.4 ng/well and about 10(3) infectious units/well estimated by a resistance-inducing factor (RIF) test, and antigens in culture fluids from chicken embryo fibroblasts infected with subgroups A, B or E of ALV. These results showed that common antigens among the subgroups were detected by the ELISA. When virus titration was performed, virus infectivity could be determined by the ELISA within 7 days after cultivation. The titer was similar to that obtained by the RIF test on 19 days after 3 subcultures. These results indicate that the ALV-isolation test by the ELISA was superior to the RIF test in rapidity and applicability to large-scale field trials. Four specific pathogen-free (SPF) chicken lines maintained in this laboratory were examined for endogenous ALV antigens by the ELISA. Sera from laying hens had considerably high absorbance (A) values, whereas albumen samples showed low A values except for some samples (7/40 hens). Although most of sera from 1-day-old SPF chicks showed lower A values than those from laying hens, some sera showed A values as high as those from viremic chicks in 2 lines. Endogenous ALV was isolated from sera from laying hens (6/40) and their albumens (4/7) with high A values. Two SPF chicken lines were found to produce endogenous virus at a high frequency.     

免疫层析试纸条(ICS)检测禽流感抗体

以纯化的禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）核蛋白作为捕捉抗原，金标兔抗鸡抗体作为金标二抗，建立检测禽流感血清抗体的胶体金免疫层析试纸条（immunochromatographic strip, ICS）。对标准阳性血清不同滴度进行检测，ICS试验的敏感性高于琼脂扩散试验（AGP）。特异性试验证实，禽流感的ICS试验与新城疫（ND）、传染性支气管炎（IBV）、鸡传染性法氏囊病（IBD）及减蛋综合症（EDS-76）均无交叉反应。同时，用ICS试验和HI试验检测105份鸡血清，两者具有较好的符合性。结果认为：禽流感ICS具有快速简便、特异、灵敏等优点。     

J亚群禽白血病病毒(ALV-J)ELISA检测方法的建立

利用抗J亚群禽白血病病毒（ALV—J）囊膜蛋白特异性单克隆抗体JE9，建立了检测ALV—J env抗原抗体免疫复合物的ELISA方法。应用该方法检测SPF鸡血清、鸡抗禽流感H9亚型阳性血清、鸡沙门氏菌阳性血清、鸡腺病毒阳性血清、鸡新城疫阳性血清．结果均为阴性，无交叉反应；抗ALV—J阳性血清与ALV—J特异性单克隆抗体JE9能相互阻断；ALV—J阳性血清经酸处理后，ELISA检测的D490差值明显下降。对部分攻毒鸡血清样本及田间ALV—J阳性血清样本进行电镜观察，可见ALV—J样病毒粒子及ALV—J样免疫复合物。经与间接免疫荧光（IFA）检测ALV—J env抗体结果比较表明，建立的ELISA方法与IFA方法两者具有较好的群体符合率，群体符合率为8／9。这些结果表明，本研究建立的ELISA方法在ALV—J的诊断中具有很好的应用前景。