鸡奇异变形杆菌外膜蛋白的抗血清制备及其荧光标记抗体检测方法的建立

为建立鸡奇异变形杆菌(P.mirabilis)直接荧光标记抗体检测方法,本研究提取P.mirabilis外膜蛋白(OMP),以OMP免疫健康新西兰家兔制备兔抗鸡P.mirabilis OMP高免血清,纯化的IgG,用FITC标记得到兔抗鸡P.mirabilis OMP-IgG的荧光标记抗体,建立直接荧光标记抗体检测方法。应用该方法检测临床样品184份,检测结果与细菌分离法和微量平板凝集比较,结果表明提取的OMP含有6种成分,分子量分别为67.0ku、63.1ku、57.5ku、53.7ku、43.0ku和31.6ku,经过优化的OMP-IgG荧光标记抗体最佳工作浓度为0.25mg/mL,最佳感作时间为30min。临床检测结果显示该方法具有简便、快速、敏感和特异性强等优点,为鸡P.mirabilis病的流行病学调查和临床快速诊断提供了技术保障。     

直接免疫荧光检测禽呼肠孤病毒方法的建立

本研究利用经纯化的原核表达禽呼肠孤病毒(ARV)结构蛋白σ3作为免疫抗原,免疫兔子三次,血清效价达到27时采血分离血清.用硫酸铵沉淀法浓缩纯化血清中的IgG,纯化的IgG用荧光素FITC加以标记.利用制备的荧光标记特异性抗体和对反应条件进行优化,建立了表达σ3蛋白荧光抗体检测ARV的诊断方法.结果经纯化获得特异性抗ARV结构蛋白σ3的荧光标记IgG抗体.用标记的抗体检测ARV病毒感染的单层细胞,出现特异性的荧光.用建立的σ3-FA方法检测接种疑似ARV感染的病料的鸡胚原代成纤维细胞,检出的阳性样品与病毒分离结果一致.表明本研究建立的σ3-FA方法检测ARV病毒有较好的特异性,可用于ARV感染的临床样品检测.     

藻胆蛋白荧光探针在动物疫病检测中的应用展望

藻胆蛋白具有无毒性、水溶性强、稳定性好、吸收光谱区域宽、斯托克位移大、荧光明亮、易交联、不易淬灭、非特异干扰小等特性,是一类新型荧光染料。藻胆蛋白及其偶联物可与抗原或抗体、核酸及其它分子交联成为荧光探针用于荧光检测。藻胆蛋白用于荧光检测使荧光检测法的灵敏度显著提高,多色荧光分析得以实现。藻胆蛋白荧光探针可用于可溶性抗原、抗体、受体、表面标记物、核酸及药物残留等固相免疫荧光检测和多色荧光分析,具有广阔的应用前景。     

兔抗鸡IgG荧光抗体的制备及应用

本试验通过提取鸡的免疫球蛋白(IgG),与弗氏完全佐剂按照1:1的比例免疫兔子3次,然后提取兔的IgG并经过异硫氰酸荧光素染色。经检测,制备出的兔抗鸡IgG荧光抗体敏感性高、特异性强,是比较理想的检测试剂。     

抗狂犬病毒单克隆抗体的纯化及标记

对一株稳定、特异、高效的单克隆抗体（mAb）进行了纯化和荧光素（FITC）的标记,利用标记产物与已有的抗狂犬病毒核蛋白单克隆抗体标记物相比较,效果良好,二者可以结合（或单独）使用;应用标记好的荧光抗体与FITC-抗狂犬病毒免疫球蛋白比较进行血清样品效价测定实验,来确定纯化、标记后的单克隆抗体的灵敏度,结果表明本实验制备的单克隆抗体与FITC-抗狂犬病毒免疫球蛋白具有相同的灵敏度,该单克隆抗体测得的血清样品效价结果与FITC-抗狂犬病毒免疫球蛋白测得的结果相同。因此,此荧光抗体可应用于狂犬病病毒检测（FAT）、病毒毒力测定（TCID50）、中和抗体实验（FAVN）等方面的检测实验,此荧光抗体可为狂犬病的相关研究提供有力的保障。     

抗鸡IgG单克隆抗体的研究

利用小鼠骨髓瘤Sp2/0细胞系与纯化鸡IgG免疫的BALB/C小鼠脾细胞融合,成功地建立了5株能持续分泌抗鸡IgG单克隆抗体(McAbs)的杂交瘤细胞株。选择产生抗体效价高、生长快的C_(44)株,扩大培养后注射于小鼠制备腹水,经硫酸铵盐析粗提后,用HRP标记,制备出McAbs酶结合物。将制备的McAbs酶结合物和多克隆抗体(PcAbs)酶结合物,采用间接ELISA,对35份鸡血清中鸡新城疫病毒(NDV)抗体以及19份鸡血清中鸡嗜血杆菌(HG)抗体进行检测,McAbs和PcAbs两者的相关系数分别为0.928和0.921,证明制备的抗鸡IgG McAbs具有特异性强、效价高的特点.     

抗猪IgG单克隆抗体的制备与应用

采用辛酸一硫酸铵盐析和SuperdexTM-200 凝胶层析分离纯化猪血清IgG,免疫BALB/c小鼠,利用细胞融合技术获得8株稳定分泌抗猪IgG 单克隆抗体的杂交瘤细胞.Ig 亚类分析表明,所制备单克隆抗体的轻链亚类均为K,重链除6H3为IgG2b外,其余7株均属于IgG1.Western blot分析显示,5株单克隆抗体识别猪IgG轻链,3株单克隆抗体识别猪IgG重链.以蛋白G亲和层析纯化单克隆抗体7H1腹水,用改良过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶(HRP)标记,结果显示,HRP 标记抗猪IgG单克隆抗体对纯化猪IgG的工作浓度达1:12 800.将HRP标记鼠抗猪IgG单克隆抗体与HRP标记羊抗猪IgG多克隆抗体应用于猪血清圆环病毒抗体检测,二者符合率为95.12%,其ELISA和Westem blot的工作浓度为1:2 000和1:10000,表明HRP标记抗猪IgG单克隆抗体具有高度的敏感性.本研究制备的酶标抗猪IgG单克隆抗体为猪病的免疫诊断试剂研究和猪细胞生物学研究提供了一种基础工具.     

抗鸡传染性腺胃炎酶标抗体的制备和应用

在前期从患病鸡腺胃内分离到呼肠孤病毒的基础上，以该病毒为免疫原对兔进行免疫制备高免血清，分离纯化IgG，进行辣根过氧化物酶（HRP）标记，并用ELISA双抗体夹心法对山东省青岛、枣庄、泰安等地区采集的传染性腺胃炎的腺胃样品进行检测，结果表明制备的抗鸡传染性腺胃炎呼肠孤病毒的酶标抗体检测传染性腺胃炎特异性强、灵敏度高、较简便。     

鹅卵黄IgG的纯化及兔抗鹅IgG酶标抗体的制备

采用三氯甲烷去脂、无水Na2S04盐析、DEAE23纤维素层析相结合的方法纯化鹅卵黄IgG,SDS-PAGE检测表明,所得鹅卵黄IgG纯度可达93%;用纯化的IgG免疫家兔,抗血清经双向琼脂扩散,证明兔抗鹅IgG抗血清效价约1:64,免疫电泳试验检测,证明得到了特异性抗血清,提取兔抗血清的IgG,用辣根过氧化物酶标记,制备了兔抗鹅IgG的酶标抗体,酶标抗体的效价为1:6400.     

小反刍兽疫免疫荧光诊断技术研究

为了建立小反刍兽疫(PPR)荧光抗体诊断方法,研究选用小反刍兽疫病毒(PPRV)Nigeria75/1减毒疫苗株制备抗原,免疫试验山羊,制备小反刍兽疫高免血清,用硫酸铵盐析法粗提免疫球蛋白(IgG),再应用提取的IgG制备异硫氰酸荧光素标记抗体。结果表明:所制备的荧光抗体对试验用Vero细胞组织抗原和犬瘟热病毒(CDV)抗原无反应性,对小反刍兽疫病毒感染细胞的检出敏感性为1×106稀释度。