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相似文献
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1.
鹅源副黏病毒NA-1株全长cDNA克隆的构建及鉴定   总被引:1,自引:1,他引:0  
应用cRACE法扩增鹅源副黏病毒NA-1株cDNA 5'末端.参照Peter等的方法设计引物,扩增鹅源副黏病毒NA-1株cDNA的3'末端.根据GenBank上发表的鹅源副黏病毒序列设计6对引物,应用RT-PCR方法分6段扩增此病毒结构基因序列,并将其连接完成后与连接有鹅源副黏病毒NA-1株末端序列的转录载体连接,构建得到全长cDNA克隆.鹅源副黏病毒NA-1株全长cDNA克隆成功构建,为下一步病毒的拯救奠定坚实的基础.  相似文献   

2.
鹅源副黏病毒融合蛋白在毕赤酵母细胞中的表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出F蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pT-F。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pT-F,回收目的基因F片段,并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαA-F。用PmeⅠ酶切pPICZαA-F使其线性化,电击转化至感受态毕赤酵母GS115菌中。PCR法鉴定阳性重组子,10 mL/L甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Westernblot分析。结果表明,在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63 ku的重组蛋白,该重组蛋白可与NA-1株鹅源副黏病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应。  相似文献   

3.
鹅源副黏病毒致弱株的“拯救”及分子生物学鉴定   总被引:1,自引:0,他引:1  
以本课题组前期构建的鹅源副黏病毒NA-1株的全长感染性克隆为模板设计2对引物,用overlap PCR方法将其F蛋白裂解位点处的112、115和117位碱性氨基酸定点突变成为具有典型弱毒株特征的非碱性氨基酸。随后将突变后的F基因序列替换全长感染性克隆的对应序列,构建突变后的克隆质粒FL-cDNA-F′。将改造后的感染性克隆质粒与pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助表达质粒共转染VT7细胞系,成功拯救出了致弱的鹅源副黏病毒。经过分子生物学鉴定,该毒株F基因序列具有典型的弱毒株特征。救获病毒的鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)为96h,表明救获的病毒毒力已被成功致弱,可以作为当前流行的鹅副黏病毒病的一个较为理想的疫苗候选株。  相似文献   

4.
构建了针对鹅源副黏病毒(GPMV)NA-1株NP及L基因的RNA干扰质粒;将转染质粒36 h后的鸡胚成纤维细胞接种病毒,通过病毒滴度、实时荧光定量RT-PCR、细胞病变以及间接免疫荧光结果分析,表明均能抑制GPMV在CEF中复制和增殖.本试验对研究GPMV复制和抗病毒治疗提供了技术基础.  相似文献   

5.
NA-1株鹅源副黏病毒表面结构蛋白HN的真核表达   总被引:1,自引:1,他引:0  
应用特异性引物,从鹅源副黏病毒NA-1株中扩增出HN蛋白基因,PCR产物纯化后克隆入pGEM-T载体,得到重组质粒pTHN。用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切pTHN,回收目的基因HN片段并将其定向克隆到pPICZαA中,构建重组质粒pPICZαAHN。用SacⅠ酶切pPICZαAHN使其线性化,并电击转化至感受态毕赤酵母细胞GS115。PCR法鉴定阳性重组子,用1%甲醇诱导表达后,进行SDS-PAGE及Western-blot分析。结果在酵母菌培养基上清中检测到相对分子质量为63000的重组蛋白,且该重组蛋白可与NA-1株病毒多克隆抗体发生特异性血清学反应,表明NA-1的HN蛋白片段在Pichiapastoris中获得成功表达。  相似文献   

6.
利用本实验室分离保存的猪源副黏病毒JL-1株来提取病毒基因组RNA.参考GenBank发表的相关禽副粘病毒Ⅰ型(Avian paramyxovirus serotype 1,APMV-1)基因组序列,设计了8对特异性引物,RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒各基因片段,并将各目的基因片段回收纯化,将纯化后的PCR产物进行测序.测定结果得到NP、P、M、F、HN、La、Lb、Lc 8段基因序列,利用DNAMAN软件进行拼接得到基因组全长cDNA序列(GenBank登录号:EU546165).序列分析结果表明,PPMV JL-1株与各地代表株核苷酸同源性87.85%~99.78%,与鹅源新城疫(GPMV)ZJ-1、NA-1株核苷酸同源性分别为83.31%、83.46%,同时根据各毒株F基因开放阅读框前389个核苷酸序列绘制出系统发育进化树,结果表明PPMV JL-1株与LaSota同属于基因Ⅱ型,不同于基因Ⅶ型的ZJ-1和NA-1株的鹅源毒株.  相似文献   

7.
以鹅源副黏病毒NA-1株F蛋白的氨基酸序列为基础,分析预测蛋白的理化性质、三维结构与B细胞的抗原表位。运用生物信息学方法及手段对NA-1株F蛋白的理化性质、亲疏水性、可及性、信号肽、跨膜结构域、二级结构等方面进行分析,预测其抗原表位。同时利用同源建模法预测其三维空间结构。结果NA-1株F蛋白存在多个潜在的抗原表位位点。该研究为进一步通过试验方法确定其优势表位和从结构出发了解其生物学功能提供了理论依据。  相似文献   

8.
稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系的构建及鉴定   总被引:1,自引:1,他引:0  
设计1对特异性引物扩增痘苗病毒VTF7-3株的T7RNA聚合酶基因并连接真核表达载体,利用Lipo-fectamineTM2000将重组质粒转染BHK-21细胞,G418筛选2周后,转入验证质粒pT7-HN,经Western-blot和间接免疫荧光鉴定后证实获得了1株能稳定表达T7RNA聚合酶的VT7细胞系。构建的VT7细胞系传30代还能够稳定的表达T7RNA聚合酶,为下一步建立有效的鹅源副黏病毒病毒反向遗传操作平台奠定了基础。  相似文献   

9.
将本实验室保存的NA-1株鹅源副黏病毒(GPMV)经SPF鸡胚增殖,收集尿囊液进行病毒纯化,提取病毒基因组RNA。参考GenBank已收录的ZJ1株GPMV基因组序列,设计了4对特异性引物,利用RT-PCR法分别特异性的扩增出病毒NP、P和L基因片段,并将目的基因片段消化、回收纯化,克隆pCI-neo表达载体,转化大肠杆菌DH5α,小提质粒选取阳性克隆酶切、PCR鉴定并进行序列测定,结果表明NP、P和L基因正确克隆到pCI-neo表达载体中,并分别命名为pCI-NP、pCI-P和pCI-L。将构建好的pCI-NP、pCI-P和pCI-L重组质粒单独转染Vero细胞,在荧光显微镜下观察到特异绿色荧光,表明NP、P和L蛋白得到成功表达。  相似文献   

10.
通过RT-PCR扩增出鹅Ⅰ型禽副黏病毒GPMV/QY97-1株F蛋白基因的cDNA,并将F基因cDNA克隆到含CMV启动子的pCI载体上,构建这一基因的真核表达质粒pC-GPMVF,以此质粒肌肉注射3周龄非免疫鸡,并分别于免疫后第2、4、6周通过ELISA方法检测抗体水平。结果证明,用重组质粒pC-GPMVF免疫鸡,能刺激机体产生抗Ⅰ型禽副黏病毒的特异性抗体和免疫应答。  相似文献   

11.
In order to rescue the env element-substitution virus, we constructed the recombinant plasmid pNX-HNenv that contained the whole myelomas strain ALV-J NX0101 genome, but with env element of hemangiomas strain ALV-J HN06. The plasmids were transfected into DF-1 cells and the rescued viruses were identified, respectively. The recombinant virus was stable in cell culture during nine passages, and could be identified by ALV-J specific monoclonal antibody JE9 and virus NX-HNenv was rescued. The results showed that the env substitution had no apparent influence on ALV-J virus rescue, virus entry and replication.  相似文献   

12.
The genome of JS/7/05/Ch isolate shared more than 99% nucleotide identity with that of Mukteswar strain. However, the pathogenicity of JS/7/05/Ch was much stronger than that of Mukteswar strain. In order to provide a good foundation for the further related research, we built the rescue system of JS/7/05/Ch in this study. Based on the genomic sequence of JS/7/05/Ch strain, eight pairs of primers were designed to amplify the genomic fragments by RT-PCR and cloned into pCR2.1 vector, to construct the plasmid pJS/7/05/Ch which contained the full-length cDNA of NDV. Then the full-length cDNA was transferred to TVT7R(0.0) vector to construct full-length NDV infectious clone, pTVT/JS705, using specific enzymes. The infectious clone together with three helper plasmids (pCI-NP, pCI-P and pCI-L) were cotransfected into BSR-T7/5 cell, and the transfection supernatant was inoculated into SPF embryonated eggs to rescue the virus. The results of HA and RT-PCR indicated that JS/7/05/Ch strain of NDV was successfully rescued.  相似文献   

13.
广东省新城疫病毒HN基因系统发育分析   总被引:2,自引:0,他引:2  
用套式RT-PCR一步法扩增了九株NDV地方强毒的HN基因,并对其中3株的HN基因片段进行了克隆、测序及同源性分析。本试验还对该毒株的系统发育情况进行了分析:广东省NDV各毒株与欧美国家I至V基因群明显分离,遗传关系较远。台湾省NDVT各毒株归属为一组并且与中国大陆毒株的遗传距离较近。其中一支FS1/95株不能归类到任何一个基因群中。广东地区从鹅群中分离到的副黏病毒GPMV株与我们从鸡体中获得的NDV FS2株有相近的亲缘关系。  相似文献   

14.
鹅源禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的生物学特性   总被引:35,自引:2,他引:33  
对新近分离到的鹅源禽副粘病毒GPMV/QY97-1株的生物学特性进行了研究。结果表明,该病毒粒子在电镜下呈球形,直径121~250nm,表面有纤突,能凝集鸡的红细胞,血凝反应能被I型禽副粘病毒阳性血清所抑制,由此初步判定该病毒属于I型禽副粘病毒,该病毒人工感染1、14、28、48日龄的鹅,发病率均为100%。致死率分别为100%、87.5%、62.5%、12.5%;人工感染25日龄的鸡,发病率和致  相似文献   

15.
鹅副粘病毒NA-1分离株HN蛋白基因的克隆与序列分析   总被引:9,自引:0,他引:9  
鹅副粘病毒分离株NA-1经11日龄鸡胚增殖后纯化.提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带.将扩增产物提纯后克隆入pMD 18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1 740bp,该基因的ORF总长为1 716 bp,编码571个氨基酸.与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1毒株与参考毒株YG97核苷酸序列同源性为97.3%,与F48E9同源性为84.5%,与La Sota为82.2%.同源性分析表明NA-1相对于NDV在HN基因上发生了较大的变异.  相似文献   

16.
从病死的鸡、鹅、鸽中分离到3株禽I型副黏病毒(CPMV、GPMV、PPMV)。毒力测定结果显示,CPMV、GPMV的毒力与鸡新城疫病毒(NDV)F48E9株的毒力相似,为强毒型;PPMV的毒力与鸡NDVLaSota株的毒力相似,为自然弱毒株。对该分离株F基因裂解位点的序列分析结果表明,CPMV、GPMVF裂解位点氨基酸序列为112K-R-Q-K-R-F117,符合强毒株的序列特征;PPMV F裂解位点氨基酸序列为112G-R-Q-G-R-L117,属于弱毒株的特征性序列。将该3株病毒制成灭活疫苗,分别免疫鸡,结果都能诱导鸡体产生较高水平的HI抗体;再分别以CPMV、GPMV攻击免疫鸡群,结果显示免疫鸡群可得到保护,而非免疫鸡群被攻击后全部致死。用HI方法检测3株病毒与Lasota株之间的交叉血凝抑制试验,结果表明LaSota与GPMV两毒株间的抗原性无明显差异,LaSota与CPMV、PPMV两毒株间的抗原性有较小的差异。本研究将有助于进一步开展禽Ⅰ型副黏病毒的致病机制和新型疫苗等方面的研究。  相似文献   

17.
鹅副粘病毒分离株NA-1株经11日龄鸡胚增殖后纯化。提取病毒的基因组RNA,采用RT-PCR扩增出与预期设计的1.7kb大小相符合的特异条带。将扩增产物提纯后克隆入pMD18-T载体,经纯化、筛选及酶切鉴定后,初步获得了含鹅副粘病毒HN基因的阳性克隆,并对阳性克隆进行了测序。测序后拼接得出HN基因的全序列长度为1740bp,该基因的ORF总长为1716bp,编码571个氨基酸。与GenBank下载的15株参考毒株比较HN基因编码区全核苷酸序列,发现所测NA-1株与国内标准强毒株F48E9核苷酸的同源性为84.5%,氨基酸的同源性为89.5%;与传统的疫苗株La Sota核苷酸的同源性为82.2%,氨基酸的同源性为88.5%;与鹅源禽副粘病毒SF02株核苷酸的同源性为97.1%,氨基酸的同源性为97.4%;与鹅源禽副粘病毒YG97株核苷酸的同源性为97.3%,氨基酸的同源性97.4%。说明NA-1株和SF02株、YG97株亲缘关系较近,它们三者可能有着共同的来源。根据基因树分析,NA-1株应属于基因VII型新城疫病毒。由此更进一步证实新城疫可以感染水禽,且对鹅具有高度的致死性。  相似文献   

18.
携带GFP基因的重组狂犬病病毒的拯救及其生物学特性研究   总被引:1,自引:1,他引:0  
刘翠  殷相平 《中国畜牧兽医》2018,45(7):1965-1971
本研究旨在构建一株携带绿色荧光蛋白(GFP)的重组病毒,以便更快速、准确地检测疫苗效价。利用基因重组技术构建含有GFP基因的重组质粒,并利用反向遗传学操作进行重组病毒的拯救,在Vero细胞进行病毒感染并收集蛋白样品进行Western blotting试验,检测外源蛋白GFP的表达情况,测定一步法生长曲线,比较与原始毒株的生物学特性差异。结果显示,本试验成功拯救出携带GFP基因的重组狂犬病病毒毒株SAD-GFP;Western blotting试验结果显示,重组病毒可表达GFP,且随着病毒感染时间的延长,蛋白表达增多;病毒结构蛋白G蛋白表达并未受外源蛋白表达的影响,重组毒株与原始毒株的生长并无明显差异;传代后GFP仍可在病毒中稳定表达。在连续传代过程中,本试验成功拯救出SAD-GFP重组毒株,GFP基因并未丢失,且蛋白表达量并未降低,证明该位点表达的外源蛋白在病毒传代过程中可持续稳定表达,且对病毒生长特性并未产生影响。  相似文献   

19.
The control of Newcastle disease (ND) in South Africa has proved difficult since 2002 following the introduction of lineage 5d/VIId Newcastle disease virus (NDV) strain ("goose paramyxovirus" - GPMV) to which commercially available ND vaccines appeared less effective. Most of the ND infections, even in fully vaccinated hens were characterized consistently by a drop in egg production. In this study, commercial and SPF hens-in-lay were vaccinated with La Sota vaccine and challenged with a GPMV isolate. Immunohistochemical labeling was used to determine the distribution of viral antigen in the oviduct of the hens. Following reports that cloacal vaccination offered better protection against egg production losses than the oro-nasal route, the efficacy of cloacal and ocular routes of vaccination against challenge were compared. Results showed that La Sota vaccine offered birds 100% protection against the virulent ND (GPMV) virus challenge from clinical disease and death, but not against infection and replication of the GPMV, as birds showed varying degrees of macropathology. Histopathology of the oviduct of infected birds revealed multifocal lymphocytic inflammation in the interstitium as well as mild glandular ectasia and mild edema. Finely granular NDV-specific immunolabeling was demonstrated in the cytoplasm of epithelial cells and mononuclear (lymphohistiocytic) cells in the interstitium of the oviduct. Both vaccine and virulent GPMV showed greatest tropism for the uterus (versus the magnum and isthmus). There was no clear difference in the protection of the oviduct and in the distribution of oviductal GPMV antigens between the two routes of vaccination.  相似文献   

20.
水泡性口炎病毒印第安纳株反基因操作系统的建立   总被引:1,自引:0,他引:1  
负链RNA病毒作为活病毒载体具有巨大的优势。本研究构建了水泡性口炎病毒印第安纳株(VSV-Ind)基因组全长cDNA克隆,建立了反向遗传操作系统并成功救获病毒。通过免疫荧光、电镜观察、RT-PCR及生长动力学研究,证实救获病毒保持典型的VSV印第安纳株特点,救获VSV的基因组内G蛋白前、后非编码区分别引入两个用于进一步构建重组病毒时外源基因插入的两个限制酶位点。本研究为新型重组活病毒疫苗载体和肿瘤治疗载体的研制及基础病毒学相关研究提供了重要的技术平台。  相似文献   

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