用PCR和PCR-RFLP方法检测和鉴定进口海鱼中的异尖线虫幼虫

应用PCR和PCR-RFLP方法对厦门口岸进口的各种海鱼中的异尖线虫幼虫进行检测鉴定。结果在带鱼、竹荚鱼、金线鱼、大眼鲷和白姑鱼等海鱼中发现了简单异尖线虫、典型异尖线虫、对盲囊线虫和针回线虫等4种异尖线虫。带鱼和竹荚鱼的异尖线虫感染率达100%,竹荚鱼异尖线虫感染强度最高,白姑鱼感染率和感染强度相对较低。少数海鱼同时感染2种以上异尖线虫,从带鱼中同时检出简单异尖线虫和针蛔线虫,从竹荚鱼中检出简单异尖线虫、对盲囊线虫和典型异尖线虫。内切酶实验结果表明,应用限制性内切酶HinfI有效鉴别上述4种异尖线虫。     

用PCR-RFLP法在海鱼中检出简单异尖线虫幼虫

2008年底至2010年初从进境的竹荚鱼、带鱼等海鱼中多次检出体色米黄色、长16～19mm的一种线虫。用异尖线虫的通用引物和特异性引物对提取的核酸进行PCR扩增,并对扩增产物进行测序和酶切。确定该线虫为简单异尖线虫。     

广州口岸进口海鱼的异尖线虫幼虫感染情况调查

本刊讯2007年9月20-22日,由我国外交部和亚洲开发银行资助,农业部国际合作与交流中心承办的中亚国家兽医人员禽流感防控技术培训班结束了在北京的首轮培训,移师青岛,在中国动物卫生与流行病学     

进境海鱼异尖线虫幼虫感染情况调查

对来自15个国家和地区的78批次、31种、共255尾海鱼进行了异尖线虫幼虫的检验,100尾海鱼检出异尖线虫幼虫感染,总感染率为39.2%(100/255).16种海鱼检出异尖线虫幼虫,占所检鱼种的51.6%(16/31).共检获异尖线虫幼虫1 554条,平均感染强度为15.5条/尾.在体重≤100 g的海鱼中感染率最高...     

舟山口岸进出境海鱼异尖线虫幼虫感染调查

为了解舟山口岸进出境鱼类自然感染异尖线虫情况,取进出境各种鱼类1 152尾,解剖鱼体进行检查。检获虫体清洗后,用70%酒精固定,在显微镜下鉴定。结果显示检出645尾感染异尖线虫幼虫,总感染率为55.99%(645/1 152),发现检出10 065条异尖线虫幼虫,总感染强度为15.60(10 065/645)。调查结果表明,进出境鱼类异尖线虫的感染率较高,生食海鱼时,应注意对异尖线虫病的预防。     

冷冻海鱼感染异尖线虫严重

异尖线虫是人畜共患寄生虫病病源之一,当人误食含有活异尖线虫蚴的海鱼或软体动物即被感染,临床表现为急性腹泻。发病后容易误诊因而得不到及时治疗,严重危胁人体健康。自1998年以来,我们先后对到达长春火车站的30车冷冻海鱼进行了检测,发现严重感染了异尖线虫。     

在进境船舶中检出鱼异尖线虫

异尖线虫是寄生于海水鱼类的一种寄生虫,可引起人畜共患传染病-异尖线虫病,该病属于我国禁止进境的动物二类寄生虫病.本病为海洋自然疫源性疾病,周而复始地在海洋中的哺乳类、甲壳类、鱼类中发生.人类主要是生食海鱼,或将鱼的内脏用于喂养畜禽以及其他经济动物,而导致食入异尖线虫引起感染发病.本病的发生与寄生异尖科线虫的鱼类宿主分布及人们的饮食习惯有关,本病呈世界性分布,主要集中于北太平洋和北大西洋沿岸及其岛屿.而与我国相邻的日本、韩国、俄罗斯等国均有发生.1992年6月8日我国农业部根据《中华人民共和国进出境动植物检疫法》第18条规定,制定公布了《进境动物一、二类传染病、寄生虫病名录》,基于异尖线虫病对我国的公共卫生有着极其重要影响,首次将海水鱼类中的异尖线虫病列入我国二类传染病、寄生虫病名录,这也是其中唯一的寄生虫病.自依据《中华人民共和国进出境动植物检疫法》实施检疫以来,许多口岸纷纷从进口的或进境国际航行船舶食品舱中的海水鱼类体内检出异尖线虫,充分说明了必须加强对海水鱼类异尖线虫的检疫,防止本病传入我国,危害人体健康和水产养殖业的发展.连云港口岸于1998年5月首次从塞浦路斯籍进境国际航行船舶中的鳕鱼体内检出异尖线虫,之后在掌握了异尖线虫的正确检疫方法后,大大地提高了本病的检出率,到1999年11月30日止共检出异尖线虫139艘次,占我局一、二类、三类检疫疫情总数的54.3%.下面将1998～1999年连云港口岸进境船舶鱼异尖线虫的检出情况作一简要分析.     

对朝鲜进口鳕鱼异尖线虫及其活力的检测情况

随着“动物防疫法”的贯彻落实,以水生动物及其产品为主的检疫工作,已是我们铁路运输动物卫生监督检验的主要工作之一;尤其是开展寄生虫实验室检验工作为水生动物检疫工作提供了可靠的技术依据。最近我们仅从朝鲜进口的一批鳕鱼中检出大量的人鱼共同感染的异尖线虫,并对虫体进行了复苏观察,发现有少数活虫存在。仅将此次鳕鱼异尖线虫检出情况及活力检测情况报告如下：1材料与方法4月23日一26日,在对晖着外贸由图们发往宁波北的四车计12O吨鲤鱼实施检疫工作中,经现场感观检验比较新鲜,但发现冷冻不良;按规定抽取样品56条鳕鱼,直接…     

简单异尖线虫PCR检测方法的建立

根据GenBank上公布的简单异尖线虫核糖体DNA的内转录区(ITS-1、5.8S、ITS-2)序列设计特异性引物,对线虫样品进行PCR扩增并将产物克隆到pMD18-T载体后测序.结果表明,扩增的目的片段大小为430 bp,与预期扩增序列同源性为99%.该PCR检测体系的特异性强,不能在宫脂线虫、伪地新线虫DNA中扩增出条带;敏感性高,最低检测的DNA含量为0.4 Pg.该检测体系的建立为简单异尖线虫的检测、鉴定和流行病学调查提供了有力的技术支持.     

简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原基因的克隆表达及免疫特性分析

为研究简单异尖线虫肌钙蛋白类过敏原的免疫特性,本研究提取了线虫总RNA,逆转录合成cDNA,PCR扩增肌钙蛋白类过敏原(Anis1)基因,克隆入pMD18-T载体,测序正确后将anis1基因亚克隆入带有组氨酸标签的表达载体pET-30a,转入大肠杆菌BL21中,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导,表达目的蛋白。通过Ni2+亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,融合蛋白采用Western blotting分析。将纯化的Anis1重组蛋白免疫小鼠,分离血清,ELISA检测不同时期血清抗体效价。酶切和DNA测序结果显示重组质粒构建成功,并诱导出重组Anis1蛋白,重组蛋白经Western blotting分析证实为目的蛋白,纯化蛋白Anis1免疫小鼠后,与对照组相比,能产生较高的抗体水平。Western blotting分析显示,重组蛋白Anis1能被免疫血清识别,说明简单异尖线虫重组蛋白Anis1具有较好的免疫原性和免疫反应性。     

巢式PCR-RFLP法检测奶牛隐孢子虫及虫种鉴定

采进口奶牛粪样200份,收集每份样品中的卵囊液,采用巢式PCR检测隐孢子虫(Cryptosporidium)18S rRNA基因,并用RFLP进行虫种鉴定,将目的片段克隆到pEGM-T easy vector,测序并进行同源性分析以进一步佐证虫种鉴定结果。结果表明,进口奶牛隐孢子虫阳性率为3.5%(7/200),514bp的目的片段不能被EcoT14 Ⅰ酶切。测序分析表明,获得的18S rRNA基因序列与NCBI上公布的微小隐孢子虫(C.parvum)相应序列同源性高达99.4%~100%,与安氏隐孢子虫(C.andersoni)同源性仅为91.1%。说明进口牛粪样中检测出的隐孢子虫为微小隐孢子虫。     

实时荧光PCR检测牛边缘无浆体方法的建立及应用

根据牛边缘无浆体表面蛋白4的保守基因序列设计特异引物AMOC9/AMOC5、AMOC10/AMOC12和特异性探针MP,首次建立了牛边缘无浆体的实时荧光PCR检测方法,检测DNA的最低限度为200 fg。对中央无浆体、绵羊无浆体、牛巴贝斯虫、双芽巴贝斯虫、羊莫氏巴贝斯虫、山羊泰勒虫、温氏附红细胞体、东方巴贝斯虫、刚地弓形虫和伊氏锥虫进行检测,无荧光检测信号。本研究用所建立的方法检测采自江苏和哈尔滨的180份抗凝血（奶牛和肉牛）,其阳性率为8.9%。结果表明,建立的实时荧光PCR检测牛边缘无浆体的方法具有较高的特异性和敏感性,可用于牛边缘无浆体病的流行病学调查、检疫和监测。     

牛源环孢子虫的发现与分子鉴定

根据GenBank上已发表的环孢子虫序列设计并合成2对引物，利用巢式PCR技术对首次在牛体内发现的形态学特征与人环孢子虫极为相似的牛源环孢子虫的18SrRNA基因进行了扩增，并以KpnⅠ酶对PCR产物进行RFLP分析；扩增出的片段纯化后克隆至pGEM-T Easy载体，对阳性克隆进行序列测定并对测序结果进行了同源性及系统发育分析。结果显示，扩增的18SrRNA基因片段大小为501bp，不含KpnⅠ酶切位点，与对照的艾美尔球虫的酶切图谱明显不同。序列同源性及系统发育分析显示该牛源环孢子虫与环孢子虫同源性最高，系统树中位于同一分支，可以确定其为一种环孢子虫。     

PCR-RFLP和特异PCR技术用于鲁道夫对盲囊线虫鉴定的研究

本研究运用新建立的Contracaecum rudolphii姊妹种的PCR-RFLP和特异PCR鉴定方法对来自我国青海湖的鲁道夫对盲囊线虫进行分子鉴定。经PCR-RFLP分析，来自我国青海湖的鲁道夫对盲囊线虫的两个样品的带型与C．rudolphiiB的酶切带型一致。经特异PCR扩增，C．rudolphii B的特异引物能从我国鲁道夫对盲囊线虫中扩增出目的片段，与对照C．rudolphii B的代表样品扩增片段大小相同。该两种方法试验结果都说明来自我国青海湖的对盲囊线虫为C．rudolphii B，与PCR-SSCP方法鉴定结果一致。本次研究结果及所建立的分子分类学方法为我国异尖线虫的进一步研究奠定了基础。     

水貂病毒性肠炎巢式PCR,PCR-RFLP联合诊断方法的建立

根据水貂肠炎细小病毒的VP2基因序列设计4条特异性引物,建立了检测水貂肠炎细小病毒的巢式PCR方法。采用一次扩增的敏感性来检测5个TCID50/mL的细小病毒MEVB株,二次扩增的敏感性来检测0.05个TCID50/mL的细小病毒MEVB株。同时,利用该方法第一轮PCR产物酶切,能够区分犬细小病毒与水貂肠炎细小病毒,具有重要的实用价值和应用的前景。     

Genetic diversity and infection levels of anisakid nematodes parasitic in fish and marine mammals from Boreal and Austral hemispheres

Anisakid nematodes have complex life-cycles that include invertebrate and vertebrate hosts at various levels of the marine food chain. Different types of habitat disturbances of the marine ecosystem (pollution, overfishing, by-catch) could impoverish the host population size, resulting in concomitant and detrimental effects on parasitic nematode populations. This in turn would lead to the loss of genetic diversity of these parasites at both the species and population levels. In order to test for a correlation existing between the genetic diversity of anisakid nematodes and habitat disturbance, the genetic variability, estimated by nuclear markers (19 allozyme loci), was evaluated among several anisakid populations from fish and marine mammals in various areas of the Boreal and Austral regions. Antarctic and sub-antarctic populations showed significantly (P<0.001) higher levels of genetic diversity (on average, He=0.23) than those from the Arctic and sub-Arctic populations and species (on average, He=0.07). Correlations between the degree of genetic variability and the levels of parasitic infections within their hosts were considered. Data revealed higher intensities in anisakid infections in Antarctic and sub-Antarctic hosts, presumably resulting from a lower degree of habitat disturbance in less stressed areas. The absence of disturbance presumably allowed anisakid species to reach a larger population size, with a reduced probability of genetic drift in their gene pools. This suggests that anisakid nematodes, and their levels of genetic diversity may be suitable indicators of the integrity of marine food webs and of the general biodiversity of a marine ecosystem.     

山羊奇异变形杆菌的分离鉴定及16SrDNA和ZapA基因的PCR-RFLP分析

从发病山羊分离到5株病原菌,对分离株进行游散行为分析,生化试验、动物试验、药敏试验及16SrDNA和ZapA基因克隆测序,选用限制性内切酶对分离株16SrDNA和ZapA基因进行PCR-RFLP分析。结果表明分离株出现游散生长现象,对丁胺卡那霉素和复达欣敏感,小鼠LD5。为2．5000×10 ^7CFU／mL-4．4453×10^7CFU／mL;分离株16SrDNA与奇异变形杆菌的同源率为99．5％～99．8％,ZapA基N与奇异变形杆菌的同源率为99．5％;PCR—RFLP分析发现,分离株酶切片段数目和大小与标准株相同。结果表明分离株是奇异变形杆菌,多态性较为单一。     

应用PCR技术检测鸽源性成分

根据鸽子线粒体DNAD-loop环基因中的保守序列,用Primer5.0设计针对鸽的特异性扩增引物。通过聚合酶链式反应从鸽样品中得到约150bp的特异条带。通过测序对扩增产物进行验证,鸽组织的PCR产物序列与基因库中检索到的相应序列相吻合。该实验建立了检测鸽动物源性成分的PCR方法,其检测灵敏度为0.1%。     

Detection and identification of banned processed animal protein in feedingstuffs by microscopic and PCR methods

The aim of the study was to present the results of comparative evaluation of the usefulness of PCR and microscopic methods for the detection of Processed Animal Protein (PAP) in feedingstuffs. In the validation study, the limit of the detection for PCR was determined on 0.05% for beef, 0.1% for pork and 0.2% for poultry meat and bone meal (MBM). Among 62 doubtful samples of feedingstuffs examined by microscopic method 41 (66.13%) were found as positive. Based on the results obtained with the use of the microscopic and PCR methods it is possible to state that the molecular biology methods can, at present, be used as a supplementary method in PAP detection.