携带猪囊虫表位的嵌合蛋白疫苗的构建及其免疫学研究

用PCR法将猪囊虫抗原表位n1、n2插入乙肝病毒核心蛋白（HBc）序列的第78～79位之间，将猪囊虫抗原表位n3接在149位之后，再将该序列克隆入pET28a载体中，构建了重组表达质粒pET28a—△c-3n，在大肠杆菌中表达出融合蛋白。命名为PCCE。将PCCE纯化后免疫小鼠，以ELISA检测小鼠的体液免疫应答，Western blot检测抗体的特异性．Dot ELISA验证所选表位的保护性。另用绦虫卵攻击免疫小鼠，以观察疫苗的保护作用。测序结果表明，重组质粒构建成功；SDS—PAGE显示，融合蛋白表达正确，电镜证实有蛋白颗粒形成。对免疫小鼠应用ELISA检测到高滴度抗体；Western blot结果表明。免疫鼠体内诱导出了3种特异性抗体；Dot ELISA结果表明，所逸表位对宿主可能具有保护性。绦虫卵攻击免疫小鼠试验表明，疫苗PCCE的相对保护率为89％。结论：成功地表达和纯化了以HBc为载体的携带3个猪囊虫表位的融合蛋白（PCCE），以PCCE作为疫苗免疫小鼠，能诱导较强的特异性体液免疫反应，免疫小鼠对绦虫卵攻击具有较好的免疫保护作用。     

新城疫病毒F蛋白抗原表位串联基因的构建及其原核表达

用自行设计的3对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因3段抗原表位区段,大小分别为81、108、105bp。应用添加互补性酶切位点的基因工程方法,将3段抗原表位基因片段拼接成多表位串联基因,大小为306bp。将此基因片段插入含组氨酸(His)基因的质粒pET-32-a中,构建了重组质粒pET-32-a-F306。经诱导表达,获得相对分子质量约为31000的融合蛋白,其中F蛋白抗原表位串联基因片段表达产物约为11000。经亲和层析,获得纯化His-F306融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗新城疫病毒F蛋白抗体。经过琼扩、ELISA及Western-blot检测,表明该融合蛋白中的抗原表位串联基因所表达的蛋白具有良好的抗原性。     

猪瘟病毒四川分离株E2基因的分子克隆、原核表达及免疫学活性分析

分子克隆猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)四川分离株E2基因,并对其进行原核表达及免疫学活性分析。PK-15细胞培养增殖CSFV四川分离株提取总RNA,运用RT-PCR扩增E2基因,定向克隆构建原核重组表达载体,转化E.coli Rosetta-gami-TM(DE3)plysS,IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测蛋白表达,Western blotting分析表达蛋白的免疫学活性。试验结果表明,成功克隆了E2基因,共1119 bp,包含有编码E2蛋白的完整序列,编码373个氨基酸;成功构建了CS-FVE2基因完整阅读框、主要抗原区原核表达载体pET-E2(pe)、pET-mE2(pe);蛋白质电泳结果显示,成功表达出约45.32、28.49 ku两目的蛋白,而且表达的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白均能被CSFV阳性血清所识别,具有良好的免疫学反应活性。因此,本试验成功获得CSFV四川分离株E2基因,表达出具有生物学活性的E2(pe)、mE2(pe)融合蛋白。     

猪瘟病毒表面抗原E2基因的克隆与原核表达

为获得可用于诊断的猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2蛋白重组抗原,对CSFV-E2的多个B细胞抗原表位进行重构和表达。将人工合成的E2蛋白多抗原表位基因与p ET-28a(+)载体连接后,转化至宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳分析蛋白可溶性,His亲和层析柱纯化蛋白并进行抗原性检测。重构后的猪瘟病毒E2基因多抗原表位基因大小约500 bp,PCR、双酶切鉴定结果显示与预期相符;重组蛋白为可溶性表达,大小约23 k Da;Western blot结果显示,重组蛋白可与猪瘟阳性血清发生特异性结合,具有良好的免疫反应性,可作为诊断抗原用于猪瘟病毒感染动物的血清抗体检测。     

牛冠状病毒S蛋白抗原表位基因的串联表达及抗血清制备

为了构建牛冠状病毒(BCoV)抗原表位基因原核表达载体,并制备多克隆抗体,利用基因合成技术获得BCoV S蛋白两段抗原表位(351 aa～403 aa、771 aa～784 aa)的基因串联体R,将其重组到pET-28a(+)质粒中,转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达抗原表位融合蛋白,用纯化的蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果显示,成功构建了BCoV抗原表位基因重组表达质粒,获得了融合蛋白的抗血清,Western-Blot检测显示,该抗血清可与BCoV的融合蛋白特异性结合。表明成功构建了BCoV抗原表位基因原核表达载体并获得了BCo V抗血清,本研究为BCoV诊断试剂盒的开发和BCoV多表位疫苗的研究奠定了基础。     

猪瘟病毒E2重组蛋白纯化和复性条件的研究

对猪瘟病毒(CSFV)C株、LT株E2基因主要抗原区在pGEX系列表达载体中原核表达的融合蛋白进行了变性、复性和纯化回收试验。用建立的变性、复性和纯化方法，获得了可溶性的纯化蛋白E2，其纯度达70％，回收率为10％。对复性纯化的E2蛋白进行了免疫活性检测，结果表明，其比未纯化蛋白的免疫活性高20倍左右。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区的克隆及其原核表达

为研究猪瘟病毒E2蛋白的抗原表位在机体免疫应答中的作用和特点,试验参照猪瘟兔化弱毒疫苗株(HCLV)的基因组序列,设计、合成了1对引物,应用RT-PCR方法扩增出长为786 bp的基因片段,命名为zE2,将zE2基因克隆到原核表达质粒pET 32a中,经酶切鉴定后转化大肠杆菌Rosetta(DE3),于37℃、1.0 mmol/L IPTG条件下诱导表达,大肠杆菌菌体裂解产物再经SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:该基因片段得到较高表达,融合蛋白的分子质量约为48 ku,主要以包涵体形式存在,且具有一定的免疫学活性。     

猪瘟病毒多表位基因的表达及其免疫原性分析

体外表达猪瘟病毒(CFSV)T、B细胞表位,并对表达产物的免疫原性进行分析.人工合成CFSV的多个T、B细胞表位及表位之间的连接linker基因,并将该基因插入pGEX-6P-1表达载体,经酶切和测序鉴定获得重组阳性克隆,成功构建了CFSV复合多表位抗原基因的原核表达质粒pGEX-BT500,转化E.coli BL21,IPTG诱导表达,纯化表达产物并免疫兔.结果:通过IPTG诱导目的基因可高效表达,SDS-PAGE结果表明,以终浓度为0.9 mmol· L-1的IPTG进行诱导,7h后表达量最高,产物分泌表达,相对分子质量约43 ku,表达产量约占菌体总蛋白的30％.Western blotting检测表明,表达的融合蛋白能与猪瘟阳性血清发生特异性反应;兔攻毒试验表明所免疫表达产物可保护(根据发热反应评价)兔.结果表明表达获得的产物具有良好的反应原性,这为应用该融合蛋白制备CSFV免疫血清学诊断试剂和多表位疫苗研究奠定了基础.     

猪流感病毒多表位融合蛋白对小鼠的免疫原性分析

作者拟利用表位多肽的抗原性及黏膜佐剂免疫增强作用,设计可通过黏膜途径免疫接种的猪流感病毒通用型疫苗.体外合成H1N1、H3N2亚型猪流感病毒表位抗原基因,C末端串联大肠杆菌热敏性肠毒素LTb基因,构建pET30(a)-ep-LTb表达载体,利用SDS-PAGE、Western blot分析重组融合蛋白表达及生物学特性,小鼠免疫试验分析融合蛋白免疫原性.SDS-PAGE检测表达蛋白相对分子质量约38 ku,主要以包涵体形式存在.重组蛋白可与抗His-tag抗体和CTB抗体发生特异性反应.ELISA及HI试验检测,经黏膜途径免疫的小鼠产生了针对重组表位模拟抗原蛋白及H1N1、H3N2亚型猪流感病毒的血清抗体及局部黏膜分泌型IgA抗体.利用猪流感病毒表位抗原与LTb基因串连获得的融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,且在黏膜接种局部产生理想的分泌型IgA抗体,能有效阻断病原由黏膜局部感染,为研制猪流感病毒通用型疫苗奠定了基础.     

检测猪瘟病毒E0抗体间接ELISA方法的建立及其初步应用

应用RT-PCR技术扩增了猪瘟病毒的E0基因片段,并将其分别克隆到pGEX-4T-1与pET-28a载体,获得了pGEX-4T-1-E0与pET-28a-E0重组表达质粒。以IPTG诱导表达的纯化GST-E0和His-E0重组蛋白为包被抗原,建立检测猪瘟病毒E0抗体的间接ELISA方法。采用方阵滴定法,确定出GST-E0抗原和His-E0抗原的最佳包被量分别为50 ng/孔和100 ng/孔,血清最佳稀释度为160倍。对80份猪瘟阴性血清样品进行了检测与统计学分析,确定出GST-E0和His-E0重组蛋白的间接ELISA方法的临界值分别为0.167和0.176。特异性、敏感性和重复性试验结果表明,本试验建立的基于GST-E0和His-E0蛋白的间接ELISA方法均具有特异、敏感和重复性好等优点。应用GST-E0和His-E0的间接ELISA方法及IDEXX E2抗体检测试剂盒平行检测88份猪血清样品,结果显示基于GST-E0和His-E0的间接ELISA方法与IDEXX试剂盒的符合率分别为78.41%和84.09%。以猪瘟病毒接毒细胞为抗原,应用免疫荧光试验(IFA)对His-E0间接ELISA和IDEXX检测试剂盒检出的阴性与阳性血清样品进行了验证,结果IFA与His-E0间接ELISA方法的符合率为93.18%;IFA与IDEXX试剂盒的符合率为90.91%,表明本试验所建立的基于His-E0的间接ELISA方法用于检测猪瘟抗体优于IDEXX公司检测E2抗体的试剂盒。该方法为鉴别E2亚单位疫苗免疫后的猪群中是否存在野毒感染提供了技术手段。     

猪瘟病毒E2蛋白与猪RACK1相互作用的鉴定

为筛选和鉴定与猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白相互作用的猪宿主蛋白,我们采用酵母双杂交方法筛选猪肺泡巨噬细胞表达文库得到与CSFV E2蛋白相互作用的宿主细胞RACK1蛋白,经共转化试验和GST pull-down试验进一步证实两者可以特异性结合,并且共聚焦试验表明两者共定位于细胞的细胞浆。本研究显示E2蛋白与宿主细胞RACK1蛋白存在相互作用,RACK1在CSFV感染过程中所发挥的功能有待进一步研究。     

猪瘟病毒E2蛋白A/D区单抗的制备及其抗原表位的初步研究

应用分子克隆技术将猪瘟病毒E2蛋白部分基因插入到载体pGEX-4T-1中构建重组质粒pGEX-4T-E（A）,在大肠杆菌Rosetta中表达融合蛋白GST-E（A）,以纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经克隆化和间接ELISA筛选,获得了C3、A1两株稳定分泌抗猪瘟病毒E2蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,ELISA结果显示,其腹水效价为1∶128000和1∶256000。Western blotting结果证实,单克隆抗体C3和A1能与猪瘟病毒（classical swine fever virus,CSFV）发生特异性的反应,表明该单抗是针对猪瘟病毒E2蛋白的保守线性表位。     

A novel dendrimeric peptide induces high level neutralizing antibodies against classical swine fever virus in rabbits

The amino acid sequence (TAVSPTTLR, 829-837aa) on the glycoprotein E2 of classical swine fever virus (CSFV) is a conserved and linear neutralizing epitope. In the present study, two peptides were constructed based the core sequence of this neutralizing epitope, the dendrimeric peptide (Th-B(4)) containing four copies of B cell epitope fused to one copy of promiscuous T helper (Th) cell epitope and the peptide Th-B containing a single copy of B cell epitope fused to one copy of Th cell epitope. The dendrimeric peptide Th-B(4) elicited high titers of neutralizing antibodies as detected in an indirect ELISA, blocking ELISA and neutralization test and induced a complete protection against CSFV C strain in rabbits. The Th-B elicited low titers of neutralizing antibodies and did not induce a protection in rabbits. These results suggest that the dendrimeric peptide Th-B(4) may be a promising marker vaccine candidate against CSFV and the multimerization is a requirement for development of a peptide vaccine.     

利用随机肽库鉴定猪瘟病毒E2蛋白抗原表位

利用噬菌体随机12肽库对抗猪瘟病毒（classical swine fever virus CSFV）糖蛋白E2特异的单抗A11进行表位鉴定，经过4轮筛选后，随机挑取10个噬菌体克隆作竞争ELISA检测。结果表明，10个克隆中除4号克隆外，其余9个均能抑制原核表达的E2蛋白和A1l单抗之间的抗原抗体反应，抑制率在35％～64％；DNA测序表明，所有产生竞争抑制作用的8个噬菌体克隆的12肽序列均舍有XXWRXXXL核心序列，而没有抑制作用的克隆则不含该核心序列；Western-blot试验证明，所挑阳性克隆均能被单抗A11识别。多序列比较发现，该核心序列与猪瘟病毒E蛋白的28～35位氨基酸TTWKEYSH有一定的同源性，人工合成的含有部分核心序列氨基酸的多肽可以与单抗A11反应，表明单抗A11所针对的抗原表位位于CSFVE2蛋白的28～35位氨基酸。     

表达猪瘟病毒E2蛋白的重组腺病毒对猪的免疫效力评价

为了进一步验证含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒（rAdV—E2）在猪体上的免疫效力,将rAdV—E2按108TCID50／头接种猪2次,同时用野生型腺病毒wtAdV作为阴性对照,当抗体上升到一定程度后用致死剂量的猪瘟强毒石门株进行攻击。结果表明,rAdV—E2免疫组（n=5）所有免疫猪在加强免疫后均产生了猪瘟特异性中和抗体,并于加强免疫后3w达到峰值,攻毒后所有猪只抗体迅速升高,除了一头猪短期体温升高外,未出现任何其它临床症状;而野生型腺病毒wtAdV免疫组（n=5）猪只在攻毒前一直没有检出特异性抗体,攻毒后全部出现典型的猪瘟临床症状和严重的病毒血症,剖检时可见典型猪瘟病理变化。这表明构建的猪瘟病毒E2基因重组腺病毒rAdV—E2免疫猪后产生了很好的免疫效果,有望成为具有开发价值的活载体疫苗。     

A common neutralizing epitope on envelope glycoprotein E2 of different pestiviruses: implications for improvement of vaccines and diagnostics for classical swine fever (CSF)?

The Pestivirus genus within the family of Flaviviridae consists of at least three species; classical swine fever virus (CSFV) found in swine and wild boar, bovine viral diarrhoea virus type 1 and type 2 (BVDV-I and BVDV-II) mainly isolated from cattle and border disease virus (BDV) preferably replicating in ovine species. Many features demonstrate differences between CSFV and other pestiviruses, BVDV-I, BVDV-II and BDV, here defined as nonCSFV, whereas other features show similarities between all different species of pestiviruses. Focussing on the major envelope glycoprotein E2, the immunodominant protein of pestiviruses, CSFV seems to be a more distinct species within the Pestivirus genus. Here we confirm on one hand the more separated grouping of CSFV by isolation of monoclonal antibodies (MAbs) raised against E2 of BVDV-I and BVDV-II. None of these MAbs recognize E2 of CSFV strains. On the other hand, only one MAb, MAb 912, was isolated against E2 of BDV. MAb 912 binds to E2 of CSFV strains and partly neutralizes CSFV. The epitope of MAb 912 is mapped in antigenic domain B of CSFV-E2. This common epitope of CSFV strains and nonCSFV strains could have implications for development of DIVA vaccines and serological diagnostics for CSF.     

兔体中和试验用猪瘟病毒阴、阳性血清国家参考品的研制

为制备和标定兔体中和试验用猪瘟病毒阴、阳性血清国家参考品,本试验制备了猪瘟病毒阴性、弱阳性和强阳性血清,通过过滤、分装、冻干、熔封,获得3亚批候选物,并进行了检验、协作标定和定值。结果显示：物理性状、无菌检验、安全检验、支原体检验、真空度测定、均匀性检验和保存有效期试验均合格;剩余水分均小于4％;特异性检验结果均为口蹄疫、伪狂犬病、猪繁殖与呼吸综合征、猪细小病毒病、牛病毒性腹泻／粘膜病抗体阴性,并且弱阳性和强阳性血清能中和猪瘟兔化弱毒而阴性血清不能中和;残余猪瘟病毒免疫荧光和套式RT—PCR核酸检测结果均为阴性;经协作标定定值,其兔体中和效价分别为：阴性、1：100.928±0.103、1：102.928±0.103,表明该候选物可以作为国家参考品。     

猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究

猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。     

猪瘟病毒蛋白E2、N^pro基因的克隆表达及纯化

克隆了猪瘟病毒（CSFV）石门株E2和Npro基因,并分别插入pGEX-6p-1表达载体中,构建了原核重组表达质粒。经IPTG诱导后,应用SDS-PAGE电泳检测结果表明,重组质粒均得以成功表达。使用超声法破碎菌体获得蛋白,将带有GST标签的融合蛋白进行亲和层析,其中E2和Npro的表达形式分别为包涵体表达和可溶性蛋白表达。将E2变性后重折叠,应用亲和层析法纯化蛋白,Western blot检测发现CSFV蛋白E2能够被CSFV阳性血清识别,具有良好的反应原性,而Npro不能与CSFV阳性血清反应。